Według Narodowego Instytutu Zdrowia Stanów Zjednoczonych (NIH) szacuje się, że na 7 000 rzadkich chorób łącznie cierpi od 3,5% do 5,9% światowej populacji, co odpowiada 263 do 446 milionom osób. Jednym z największych wyzwań w przypadku chorób rzadkich jest ich identyfikacja, co ma kluczowe znaczenie dla umożliwienia pacjentom i rodzinom postawienia diagnozy i możliwego kierunku na przyszłość. Dlatego badacze chorób rzadkich na całym świecie badają, jak szybciej uzyskać odpowiedzi.

Genetyczne podłoże chorób rzadkich

NIH szacuje obecnie, że około 80% rzadkich chorób ma podłoże genetyczne. Zespół naukowców z Centrum Medycznego Uniwersytetu Radboud (Radboudumc) w Nijmegen w Holandii zastanawia się, w jaki sposób można skrócić czas potrzebny na identyfikację i nazwanie rzadkiej choroby genetycznej danej osoby. „Moje badania skupiają się na znalezieniu najlepszego sposobu diagnozowania molekularnego pacjentów z rzadką chorobą genetyczną. Moim ostatecznym celem jest, aby była to szybka diagnoza, uzyskana w sposób najmniej inwazyjny, ale także opłacalny dla naszego systemu opieki zdrowotnej” – wyjaśniła Lisenka Vissers, Zakład Genetyki Człowieka i Instytut Badawczy Radboudumc ds. Innowacji Medycznych, Centrum Medyczne Uniwersytetu Radboud Nijmegen, Holandia. Vissers przewiduje scenariusz, w którym diagnoza mogłaby zostać postawiona w czasie krótszym niż tydzień na podstawie prostego badania krwi. Świadoma głębokich trudności, jakie napotykają osoby bez diagnozy genetycznej, poświęciła się nieustannemu poszukiwaniu niezbędnych narzędzi, technik i podejść, aby przyspieszyć proces diagnostyczny tak szybko, jak to możliwe.

Pokonywanie ograniczeń technicznych

„Dzisiaj większość pacjentów z rzadką chorobą genetyczną może już przejść „jeden test”, aby ustalić tę diagnozę, taki jak sekwencjonowanie egzomu lub genomu metodą krótkiego odczytu. To już jest świetne rozwiązanie, ponieważ strategie te umożliwiają diagnozę genetyczną u około 30–40% pacjentów. Jednak znaczna część pacjentów wymaga więcej niż jednego badania genetycznego, często wykonywanego sekwencyjnie, co wydłuża całkowity czas do postawienia diagnozy. Co więcej, w przypadku większości pacjentów przyczyna genetyczna pozostaje nieuchwytna pomimo wszystkich przeprowadzonych badań” – stwierdził Vissers. „Z perspektywy badawczej stawiam hipotezę, że albo technologie krótkiego odczytu nie zidentyfikowały jeszcze przyczyny genetycznej ze względu na ograniczenia technologiczne i w związku z tym do ich znalezienia potrzebne są nowe technologie, albo też nie potrafimy prawidłowo rozpoznać wariantów genetycznych jako patogennych ze względu na ich lokalizację wpływające na sekwencję niekodującą, wymagające dalszych czynności funkcjonalnych, aby zrozumieć ich znaczenie dla choroby”.

Obietnica sekwencjonowania HiFi

Vissers i jej zespół w Radboudumc jako pierwsi przyjęli sekwencjonowanie o długim odczycie i w swoich badaniach korzystali z platform PacBio Sequel. „W naszych początkowych badaniach, w których testowaliśmy osoby z genetycznie niezdiagnozowanymi zaburzeniami neurorozwojowymi, dostrzegliśmy już ogromny potencjał długich odczytów, ponieważ teraz mogliśmy zsekwencjonować części ludzkiego genomu w jednym teście, które wcześniej przy krótkich odczytach pozostawały niedostępne. Regiony te obejmowały także części ludzkiego genomu zawierające dobrze opisane geny znanych chorób, co podkreśla znaczenie długich odczytów nad krótkimi odczytami. Sekwencjonowanie HiFi ponownie zmieniło zasady gry – dokładność wykrywania (od nowa) Solidne wartości SNV w połączeniu z wyższą przepustowością Revio umożliwiły przeprowadzenie większych badań skupiających się na hipotezie, że sekwencjonowanie z długim odczytem pozwala na wykrycie wcześniej nieodkrytej zmienności genetycznej.

Zespół Radboudumc jest głęboko przekonany, że każdy pacjent cierpiący na rzadką chorobę genetyczną zasługuje na dostęp do testu, który zapewnia największe prawdopodobieństwo dostarczenia wyjaśnień w możliwie najkrótszym czasie. Zasada ta napędza ich ciągłe wysiłki badawcze, ponieważ starają się przekształcić te aspiracje w rzeczywistość. Dążąc do osiągnięcia tego celu, zainicjowali badanie Nijmegen Revio-500, co stanowi znaczący krok naprzód w ich zaangażowaniu w zwiększanie potencjalnych możliwości badań diagnostycznych w tych trudnych warunkach.

„W pierwszej części badania wybraliśmy 100 „trudnych” wariantów genetycznych, które wcześniej zidentyfikowano jako genetyczną przyczynę choroby przy użyciu innych metod. Trudne odnosi się tutaj do wariantów zlokalizowanych w regionach homologii sekwencji, posiadających pseudogeny, będących (dłuższymi) powtórzeniami ekspansji, defektami metylacji, inwersjami itp. Oczekujemy, że genomy z długim odczytem HiFi nie będą miały problemu z ich wykryciem, dzięki czemu możemy pokazać, że te genomy można wykorzystać do wykrycia „czego wcześniej nie mogliśmy zidentyfikować”. Ponadto mamy nadzieję pokazać, że uzyskujemy bardziej szczegółowe informacje z długo czytanych genomów niż uzyskane w rutynowo stosowanych przepływach pracy, takich jak informacje o fazach i dokładny kontekst sekwencji dla powtarzających się ekspansji. W drugiej części badania wykorzystamy próbki uczestników badania, w przypadku których potencjalna przyczyna genetyczna pozostaje nieuchwytna po wyczerpaniu wszystkich innych możliwości wykrywania, w tym egzomów i/lub genomów o krótkim odczycie i/lub dodatkowych testów ukierunkowanych. Mamy nadzieję pokazać, że wykorzystując genomy HiFi do długiego odczytu, możemy teraz zidentyfikować warianty, które nie zostały wcześniej zidentyfikowane. Potencjalne ustalenia stanowiłyby dobrą zachętę do dalszego wdrażania przy opracowywaniu przyszłego przepływu pracy diagnostycznej”.

Vissers i jej współpracownicy są o krok od zakończenia początkowej fazy badań, po dokonaniu ważnego odkrycia: można skutecznie zidentyfikować 95% wariantów. Spośród nich 87% jest rozpoznawanych automatycznie za pomocą istniejących procesów analitycznych, podczas gdy pozostałe 7% wymaga ręcznej selekcji, na przykład sprawdzania dopasowanych odczytów. Warianty, które okazały się trudne do wykrycia, obejmują ekspansje powtórzeń bogatych w AG, a także warianty zlokalizowane w regionach o dużej liczbie powtórzeń chromosomu Y i/lub akrocentrycznych ramionach p. Co imponujące, zespół dokonał już także pierwszego nowatorskiego odkrycia w kohorcie badanej w ramach drugiego celu projektu.

Oprócz zwycięstw nowego wyjaśnienia zespół miał także kilka miłych niespodzianek.

„Mieliśmy nadzieję udowodnić nasze hipotezy, zarówno mówiące o tym, że sekwencjonowanie HiFi potencjalnie umożliwi nam zastąpienie naszych obecnych przepływów pracy, jak i umożliwienie badań prowadzących do zwiększenia wydajności diagnostycznej. Jednak fakt, że udało nam się wygenerować tak wysokiej jakości dane już w pierwszym uruchomieniu i że warianty są tak łatwo wykrywalne, pozytywnie mnie zaskoczył.” stwierdził Visser.

Na podstawie dotychczasowych wstępnych wyników Vissers i jej zespół „jest już pewien, że odczyty HiFi mogą zastąpić wiele testów genetycznych i przepływów pracy stosowanych obecnie do wykrywania wariantów w bardziej złożonych regionach genomu. Naszymi następnymi krokami będą dalsze badanie, w jaki sposób możemy potencjalnie umieścić sekwencjonowanie genomu HiFi w przyszłych rutynowych testach diagnostycznych i określić, które testy można potencjalnie zastąpić sekwencjonowaniem HiFi”.

Chcesz dowiedzieć się więcej na temat badań nad rzadkimi chorobami w Radboudumc?

Jeśli chcesz dowiedzieć się więcej na temat badań w Radboudumc i usłyszeć od samej Lisenki, zapraszamy do wzięcia udziału w webinarium na żywo, które odbędzie się 13 marca 2024 r.