W niedawnym badaniu opublikowanym w Nowe choroby zakaźnegrupa badaczy porównała rozmieszczenie receptorów kwasu sialowego (SA) w drogach oddechowych i gruczołach mlekowych bydła mlecznego naturalnie zakażonego wysoce patogennym wirusem grypy ptaków (HPAI) A(H5N1) (wysoce zaraźliwy i śmiertelny szczep wirusa grypy ptaków H5N1).

Tło

W marcu 2024 r. Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USA) poinformował o pierwszym wykryciu wirusa HPAI H5N1 u bydła mlecznego w USA. Obecność specyficznych receptorów wirusa na komórkach gospodarza wpływa na podatność na zakażenie HPAI H5N1. Nadal jednak dystrybucja receptorów SA u bydła mlecznego, szczególnie w gruczołach mlekowych, pozostaje słabo poznana. Konieczne są dalsze badania w celu wyjaśnienia mechanizmów transmisji i trwałości HPAI H5N1 u bydła mlecznego oraz ich implikacji dla zdrowia publicznego i przemysłu mleczarskiego.

O badaniu

W marcu 2024 r. u dwóch dorosłych krów mlecznych rasy holsztyńskiej w Teksasie zdiagnozowano zakażenie wirusem HPAI H5N1 w Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory. Krowy wykazywały objawy, w tym zmniejszoną laktację i żółte, zagęszczone mleko.

Diagnozę potwierdzono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (rRT-PCR) i immunohistochemii w gruczołach piersiowych i płucach. Utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie skrawki tkanek tchawicy, płuc i gruczołów piersiowych, a także próbki mleka, pobrano do dalszej analizy.

W przekrojach tkanek potwierdzono obecność kwasu nukleinowego genu macierzy wirusa grypy typu A (IAV) przy użyciu testu hybrydyzacji RNA in situ (RNAscope), a zmiany makroskopowe i mikroskopowe przebadano przy użyciu chromogenicznej immunohistochemii IAV i rRT-PCR.

Próbki mleka poddano cytocentrifudze i barwiono zmodyfikowanym barwnikiem Wrighta w celu oceny cytologicznej. Różnicową liczbę komórek określono przy powiększeniu ×1000, licząc 100 komórek jądrzastych. W celu scharakteryzowania receptora przygotowano utrwalone formaliną, zatopione w parafinie skrawki gruczołu mlekowego i barwiono je metodą podwójnego barwienia lektynowego i immunochemicznego.

Proces barwienia obejmował inkubację sekcji ze specyficznymi lektynami i streptawidyną sprzężoną z Alexa Fluor 647, a następnie immunobarwienie nukleoproteiną grypy typu A (IAV-Np). Wielokolorowe barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono przy użyciu przeciwciał przeciwko cytokeratynie i jonizowanej cząsteczce wiążącej wapń 1 (Iba1) (marker makrofagów).

Preparaty badano i obrazowano za pomocą mikroskopu trójokularowego Olympus wyposażonego w kamerę DP23 i oprogramowanie CellSyns Dimension. Kontrole negatywne składały się z pierwotnej lektyny lub pominięcia przeciwciał, a kontrole pozytywne przeprowadzono na tkankach świń i tkance płuc świń zakażonej wirusem IAV.

Wyniki badań

Dwie naturalnie zakażone mleczne krowy rasy holsztyńskiej z infekcjami wirusem HPAI H5N1 wybrano do retrospektywnej oceny. Krowy wykazywały objawy kliniczno-patologiczne, a ich infekcja została potwierdzona za pomocą wcześniej zgłoszonych metod wykrywania i danych sekwencjonowania.

Badanie histologiczne gruczołu mlekowego wykazało ostre umiarkowane wieloogniskowe zapalenie gruczołu mlekowego charakteryzujące się osłabieniem nabłonka i wewnątrzświatłowym zapaleniem neutrofilowym. Immunohistochemia w kierunku IAV-Np w gruczole mlekowym wykazała wewnątrzjądrową i wewnątrzcytoplazmatyczną immunoreaktywność w komórkach nabłonka pęcherzykowego i międzyzrazikowego przewodów. Cytologiczna ocena mleka z dotkniętego gruczołu wykazała umiarkowane do znacznego zapalenie neutrofilowe i łagodne zapalenie makrofagowe zgodne z zapaleniem gruczołu mlekowego.

Celem badania była ocena rozmieszczenia receptorów SA α2-3 i α2-6 w tkankach układu oddechowego i gruczołu mlekowego zakażonych krów przy użyciu histochemii lektyny opartej na fluorescencji i chromogenii.

Znakowanie aglutyniny Sambucus nigra (SNA) (lektyny, która wiąże się specyficznie z kwasem sialowym połączonym z α2,6 do galaktozy lub N-acetylogalaktozaminą) obserwowano w gruczołach podśluzówkowych, komórkach kubkowych oraz komórkach odpornościowych śródnabłonkowych i blaszki właściwej tchawicy i oskrzeli. Znakowanie lektyny I (MAL-I) Maackia amurensis (lektyny, która wiąże się specyficznie z kwasem sialowym połączonym z α2,3 do galaktozy) i MAL-II było słabe do umiarkowanego, wieloogniskowe i obserwowane w nabłonku oddechowym tchawicy. W gruczole sutkowym znakowanie MAL-II i SNA było wyrażone w nieuszkodzonych pęcherzykach wydzielniczych, a SNA obserwowano również w nieuszkodzonych przewodach międzyzrazikowych. Nie obserwowano wykrywalnego znakowania MAL-I lub IAV-Np w nieuszkodzonych przekrojach gruczołu sutkowego.

Znakowanie fluorescencyjne zapewniało bardziej definitywną czułość i lokalizację w porównaniu z chromogenicznymi testami opartymi na lektynie. W zakażonym gruczole sutkowym pancytokeratyna (marker nabłonkowy) i Iba1 zostały użyte do oceny wewnątrzkomórkowego rozmieszczenia IAV-Np. Współznakowanie IAV-Np z pancytokeratyną obserwowano w komórkach wyściełających przewody międzyzrazikowe i pęcherzyki wydzielnicze, przy czym intensywniejsze znakowanie występowało w nabłonku pęcherzyków. Komórki wewnątrzświatłowe w pęcherzykach wydzielniczych i przewodach wykazywały zarówno wewnątrzjądrową, jak i cytoplazmatyczną ekspresję IAV-Np, powszechnie znakowaną pancytokeratyną i rzadkimi komórkami Iba1-pozytywnymi.

Znakowanie wewnątrzjądrowe IAV-Np współlokalizowało się z MAL-II i SNA w komórkach nabłonkowych wyściełających pęcherzyki wydzielnicze. Współznakowanie IAV-Np i SNA obserwowano również w komórkach nabłonkowych przewodów, podczas gdy MAL-II nie wykryto w przewodach. Znakowanie MAL-I nie zostało znalezione w przewodach wydzielniczych ani pęcherzykach, co uniemożliwia jego wykrycie z IAV-Np.

Wnioski

Podsumowując, obecność wirusa HPAI H5N1 u bydła, zwłaszcza w gruczole mlekowym i mleku, podkreśla zdolność adaptacji IAV do gatunków nietypowych i potrzebę aktywnego nadzoru. IAV wykorzystują specyficzne receptory SA do zakażenia gospodarza. Ptasie IAV preferują wiązania SA α2,3, podczas gdy ssacze IAV, w tym te od ludzi i świń, preferują wiązania SA α2,6. W badaniu tym stwierdzono oba typy receptorów SA w drogach oddechowych i gruczołach mlekowych bydła mlecznego, co wskazuje na możliwość zakażenia międzygatunkowego.