Znaczna część ludzkiego genomu składa się z regionów regulatorowych, które kontrolują, które geny ulegają ekspresji w danym momencie w komórce. Te elementy regulatorowe mogą znajdować się w pobliżu genu docelowego lub w odległości do 2 milionów par zasad od celu.

Aby umożliwić te interakcje, genom zapętla się w trójwymiarowej strukturze, która zbliża do siebie odległe regiony. Korzystając z nowej techniki, naukowcy z MIT wykazali, że mogą mapować te interakcje ze 100 razy wyższą rozdzielczością niż było to wcześniej możliwe.

„Za pomocą tej metody generujemy mapy genomu 3D o najwyższej rozdzielczości, jakie kiedykolwiek zostały wygenerowane, i widzimy wiele interakcji między wzmacniaczami i promotorami, których wcześniej nie widziano”, mówi Anders Sejr Hansen, kierownik ds. Underwood-Prescott Career Development Assistant Professor of Biological Engineering na MIT i główny autor badania. „Cieszymy się, że możemy odsłonić nową warstwę struktury 3D dzięki naszej wysokiej rozdzielczości”.

Odkrycia naukowców sugerują, że wiele genów wchodzi w interakcje z dziesiątkami różnych elementów regulacyjnych, chociaż potrzebne są dalsze badania, aby określić, które z tych interakcji są najważniejsze dla regulacji danego genu.

MIT postdoc Miles Huseyin jest także głównym autorem artykułu, który ukazał się dzisiaj w Genetyka przyrody.

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości

Naukowcy szacują, że ponad połowa genomu składa się z elementów regulatorowych, które kontrolują geny, co stanowi zaledwie około 2 procent genomu. Badania asocjacyjne całego genomu, które łączą warianty genetyczne z określonymi chorobami, zidentyfikowały wiele wariantów pojawiających się w tych regionach regulacyjnych. Ustalenie, z którymi genami wchodzą w interakcje te elementy regulacyjne, może pomóc naukowcom zrozumieć, w jaki sposób powstają te choroby i potencjalnie, jak je leczyć.

Odkrycie tych interakcji wymaga mapowania, które części genomu oddziałują ze sobą, gdy chromosomy są upakowane w jądrze. Chromosomy są zorganizowane w jednostki strukturalne zwane nukleosomami — nici DNA ciasno owinięte wokół białek — pomagając chromosomom zmieścić się w małych granicach jądra.

Aby przeprowadzić Hi-C, naukowcy używają enzymów restrykcyjnych do pocięcia genomu na wiele małych kawałków i biochemicznego połączenia fragmentów, które są blisko siebie w przestrzeni 3D w jądrze komórki. Następnie określają tożsamość oddziałujących elementów, wzmacniając je i sekwencjonując.

Chociaż Hi-C ujawnia wiele informacji na temat ogólnej trójwymiarowej organizacji genomu, ma ograniczoną rozdzielczość, aby wykryć określone interakcje między genami a elementami regulatorowymi, takimi jak wzmacniacze. Wzmacniacze to krótkie sekwencje DNA, które mogą pomóc aktywować transkrypcję genu poprzez wiązanie się z promotorem genu — miejscem, w którym rozpoczyna się transkrypcja.

Aby osiągnąć rozdzielczość niezbędną do znalezienia tych interakcji, zespół MIT oparł się na nowszej technologii o nazwie Micro-C, która została wynaleziona przez naukowców z University of Massachusetts Medical School, kierowanych przez Stanleya Hsieha i Olivera Rando. Micro-C został po raz pierwszy zastosowany w pączkujących drożdżach w 2015 r., a następnie został zastosowany do komórek ssaków w trzech artykułach w 2019 i 2020 r. przez naukowców, w tym Hansena, Hsieha, Rando i innych z University of California w Berkeley i UMass Medical School.

Micro-C osiąga wyższą rozdzielczość niż Hi-C dzięki zastosowaniu enzymu znanego jako nukleaza mikrokokowa do pocięcia genomu. Enzymy restrykcyjne Hi-C tną genom tylko w określonych sekwencjach DNA, które są losowo rozmieszczone, co daje fragmenty DNA o różnych i większych rozmiarach. Natomiast nukleaza mikrokokowa równomiernie tnie genom na fragmenty wielkości nukleosomu, z których każdy zawiera od 150 do 200 par zasad DNA. Ta jednorodność małych fragmentów zapewnia Micro-C lepszą rozdzielczość niż Hi-C.

Ponieważ jednak Micro-C bada cały genom, to podejście wciąż nie zapewnia wystarczająco wysokiej rozdzielczości, aby zidentyfikować rodzaje interakcji, które naukowcy chcieli zobaczyć. Na przykład, jeśli chcesz zobaczyć, jak 100 różnych miejsc genomu oddziałuje ze sobą, musisz zsekwencjonować co najmniej 100 pomnożone przez 100 razy, czyli 10 000. Ludzki genom jest bardzo duży i zawiera około 22 milionów miejsc o rozdzielczości nukleosomów. Dlatego mapowanie całego ludzkiego genomu metodą Micro-C wymagałoby co najmniej 22 milionów pomnożonych przez 22 miliony odczytów sekwencjonowania, co kosztowałoby ponad 1 miliard dolarów.

Aby obniżyć ten koszt, zespół opracował sposób przeprowadzania bardziej ukierunkowanego sekwencjonowania interakcji genomu, co pozwoliło im skupić się na segmentach genomu, które zawierają interesujące geny. Koncentrując się na regionach obejmujących kilka milionów par zasad, liczba możliwych miejsc genomowych zmniejsza się tysiąckrotnie, a koszty sekwencjonowania zmniejszają się milion razy, do około 1000 USD. Nowa metoda, zwana Region Capture Micro-C (RCMC), jest w stanie niedrogo generować mapy 100 razy bogatsze w informacje niż inne opublikowane techniki za ułamek kosztów.

„Teraz mamy metodę uzyskiwania map struktury genomu 3D w bardzo wysokiej rozdzielczości w bardzo przystępny sposób. Wcześniej było to tak niedostępne finansowo, ponieważ aby uzyskać wysoką rozdzielczość, potrzebne były miliony, jeśli nie miliardy dolarów” — mówi Hansen. „Jedynym ograniczeniem jest to, że nie możesz uzyskać całego genomu, więc musisz wiedzieć w przybliżeniu, który region Cię interesuje, ale możesz uzyskać bardzo wysoką rozdzielczość w bardzo przystępnej cenie”.

Wiele interakcji

W tym badaniu naukowcy skupili się na pięciu regionach o różnej wielkości od setek tysięcy do około 2 milionów par zasad, które wybrali ze względu na interesujące cechy ujawnione we wcześniejszych badaniach. Należą do nich dobrze scharakteryzowany gen o nazwie Sox2, który odgrywa kluczową rolę w tworzeniu tkanek podczas rozwoju embrionalnego.

Po przechwyceniu i zsekwencjonowaniu interesujących segmentów DNA naukowcy odkryli wiele wzmacniaczy, które wchodzą w interakcje z Sox2, a także interakcje między pobliskimi genami i wzmacniaczami, których wcześniej nie widziano. W innych regionach, zwłaszcza tych pełnych genów i wzmacniaczy, niektóre geny wchodziły w interakcje z aż 50 innymi segmentami DNA, a średnio każde oddziałujące miejsce kontaktowało się z około 25 innymi.

„Ludzie widzieli już wiele interakcji z jednego fragmentu DNA, ale zwykle jest to rzędu dwóch lub trzech, więc zobaczenie tak wielu z nich było dość znaczące pod względem różnic” – mówi Huseyin.

Jednak technika badaczy nie ujawnia, czy wszystkie te interakcje występują jednocześnie, czy w różnym czasie, ani które z tych interakcji są najważniejsze.

Naukowcy odkryli również, że DNA wydaje się zwijać w zagnieżdżone „mikroprzedziały”, które ułatwiają te interakcje, ale nie byli w stanie określić, w jaki sposób powstają mikroprzedziały. Naukowcy mają nadzieję, że dalsze badania mechanizmów leżących u ich podstaw mogą rzucić światło na fundamentalne pytanie, w jaki sposób geny są regulowane.

„Chociaż obecnie nie jesteśmy świadomi, co może powodować te mikroprzedziały, i mamy przed sobą wszystkie te otwarte pytania, mamy przynajmniej narzędzie do naprawdę rygorystycznego zadawania tych pytań” — mówi Goel.

Oprócz poszukiwania odpowiedzi na te pytania, zespół MIT planuje również współpracę z naukowcami z Bostońskiego Szpitala Dziecięcego w celu zastosowania tego typu analizy do regionów genomu, które zostały powiązane z zaburzeniami krwi w badaniach asocjacyjnych całego genomu. Współpracują również z naukowcami z Harvard Medical School w celu zbadania wariantów związanych z zaburzeniami metabolicznymi.

Christine Eyler, instruktor medyczny w Duke University School of Medicine, mówi, że nowa technika zapewni cenne narzędzie do analizy ultradrobnej architektury pętli chromatyny.

„Przewiduję, że połączenie ultrarozdzielczych danych pętli kontaktowej RCMC z innymi testami, które definiują określone elementy regulacyjne, ujawni ważne nowe spostrzeżenia dotyczące związku między strukturą jądrową a funkcją regulacyjną genów” – mówi Eyler, który nie był zaangażowany w to badanie. „Po przeprowadzeniu testu w naszej własnej grupie byliśmy pod wrażeniem faktu, że protokół jest łatwy do przestrzegania w formie, w jakiej został napisany (nawet dla naukowców, którzy wcześniej nie mieli doświadczenia w testach topologicznych) i jest bardzo wydajny ekonomicznie, biorąc pod uwagę bogactwo informacji, które zapewnia ”.

Badania zostały sfinansowane przez Koch Institute Support (podstawowy) Grant z National Cancer Institute, National Institutes of Health, National Science Foundation, nagrodę Solomona Buchsbauma Research Support Committee Award, Koch Institute Frontier Research Fund, stypendium NIH oraz Stypendium EMBO.