Pochodzenie próbek

Próbki biologiczne z wyspy Reunion pochodziły z dwóch różnych kolekcji. Kolekcja CARBO składała się z prospektywnej kohorty pacjentów z infekcjami arbowirusowymi, zarejestrowanych na stronieclicaltrials.gov (NCT01099852). CARBO został uruchomiony przez Szpital Uniwersytecki na La Martynice w 2010 r. i rozszerzony o pacjentów z Reunion w 2018 r. Druga kolekcja, DEMARE, powstała w ramach przekrojowego badania epidemiologicznego przeprowadzonego w latach 2019–2020. Obie kolekcje zostały zatwierdzone przez Francuski Komitet Ochrony Jednostek. Od wszystkich uczestników uzyskano pisemną zgodę. Próbki krwi z Seszeli zostały pobrane przez Ministerstwo Zdrowia Seszeli podczas epidemii w okresie od stycznia 2015 r. do grudnia 2016 r.

Krew pobrano od pacjentów z potwierdzonym badaniem serologicznym, u których wystąpił jeden lub kilka objawów dengi, w tym gorączka, ból mięśni, ból głowy, astenia i małopłytkowość, oraz bez historii podróży w ostatnim czasie. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo wykrycia obecności wirusowego RNA, próbki użyte w badaniu pochodziły od pacjentów włączonych do kohorty w ciągu pierwszych siedmiu dni od wystąpienia objawów. Pobieranie zostało przeprowadzone przez akredytowanych specjalistów w 10 ml probówkach z EDTA. W ciągu dwóch godzin po pobraniu próbki wirowano przy 2000 g przez 10 minut w temperaturze 20°C. Supernatanty przeniesiono do nowych probówek, homogenizowano przez odwrócenie, podzielono na porcje do nowych 2 ml probówek, oznakowano, następnie zamrożono i przechowywano w -80°C do użycia.

Ekstrakcja i amplifikacja wirusowego RNA

Aby potwierdzić obecność i ilość RNA DENV-1 w wybranych próbkach, przeprowadzono ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). W skrócie, z próbek surowicy wyekstrahowano całkowite kwasy nukleinowe przy użyciu zestawu do oczyszczania QIAamp® Mini Kit zgodnie z zaleceniami producenta (QIAGEN). Do RT-qPCR użyliśmy zestawu QIAGEN OneStep zgodnie z instrukcjami producenta (QIAGEN). Przygotowano mieszany roztwór z matrycą RNA (5 µl), sondą TaqMan (FAM-ACACCTCAAGCTAA-TAMRA) i starterami (Forward 5′-GAACATGGRACAAYTGCAACYAT-3′; Reverse 5′-CCGTAGTCDGTCAGCTGTATTTC-3′) specyficznymi dla DENV-1. Program termocyklera składał się z etapu retrotranskrypcji trwającego 45 minut w 45 ° C, denaturacji przez 5 minut w 95 ° C, a następnie 40 cykli amplifikacji (72 ° C przez 5 s i 56 ° C przez 60 s). Liczbę kopii wirusowego RNA oszacowano na podstawie krzywej standardowej zgodnie z metodologią opublikowaną przez HAS (Haute Autorité de Santé, Francja). Plazmidy zawierające ukierunkowany DENV-1 zsyntetyzowano w GeneCust (Francja) i zastosowano jako krzywą standardową w stężeniach 10¹ do 10⁸ kopii RNA na µl.

Gen E amplifikowano w celu potwierdzenia próbek dodatnich pod względem RT-qPCR. cDNA zsyntetyzowano z wyekstrahowanego RNA przy użyciu zestawu ProtoScript® II Reverse Transcriptase Kit z losowymi starterami zgodnie z instrukcjami producenta (New England BioLab, USA) i amplifikowano przy użyciu protokołu zagnieżdżonego PCR, jak opisano wcześniej [9]. W skrócie, zaprojektowaliśmy zdegenerowane startery ukierunkowane na fragment (~ 700–800 pz) genu E kodującego białko otoczki. Pierwszą rundę reakcji amplifikacji przeprowadzono ze starterami DNV1-E-F1 (CAC TGG TGG AAG AAC AAG ACG C) i DNV1-E-R2 (CMA CDG AYG TGA ACA CYC CTC C) generując fragment o wielkości około 1100 bp. W drugiej rundzie użyto starterów DNV1-E-F2 (ACG GAG CTC TYA CAT TGG ACT G) DNV1-E-R2 (CMA CDG AYG TGA ACA CYC CTC C) i wygenerowano fragment o wielkości 750 bp. Amplifikację PCR przeprowadzono na termocyklerze PCR System 2700 (ABI Applied Bio-system™). Programy amplifikacji były następujące: 94°C przez 2 minuty; 3 cykle 95°C przez 5 s, 60°C przez 30 s, 72°C przez 30 s; 3 cykle 95°C przez 5 s, 55°C przez 30 s, 72°C przez 30 s; i 28 cykli 95°C przez 5 s, 50°C przez 30 s, 72°C przez 1 min 30 s; 72°C przez 7 min. Zamplifikowane produkty sprawdzono najpierw na żelu do elektroforezy (dodatkowy plik), a następnie próbki wykazujące amplikony o oczekiwanych rozmiarach zsekwencjonowano metodą Sangera (Genoscreen, Lille, Francja).

Izolacja wirusa

Testy izolacji wirusów przeprowadzono przez zaszczepienie DENV-1 PCR-dodatnich surowic od pacjentów z wiremią na monowarstwy komórek Vero E6. Kultury sprawdzano codziennie. Gdy obserwowano efekty cytopatyczne, supernatanty (pasaż 1) zbierano przez wirowanie i przechowywano w temperaturze -80°C. Obecność wirusowego RNA potwierdzono za pomocą RT-qPCR, jak powyżej, oraz przez miareczkowanie wirusowych cząstek zakaźnych przy użyciu testu jednostek tworzących łysinki [10].

Sekwencjonowanie i analiza genomowa

Dane genomowe zostały wygenerowane przy użyciu sekwencjonowania Oxford Nanopore Technologies (MinION) w oparciu o protokół kafelkowania amplikonu lub sekwencjonowania strzelby Illumina lub przez połączenie danych z obu platform sekwencjonowania [15].

Do sekwencjonowania Illumina, biblioteki wygenerowano z 10 ng cDNA stosując Celero™ PCR Workflow z fragmentacją enzymatyczną (DNA-Seq) zgodnie z instrukcjami producenta. Sekwencjonowanie przeprowadzono na platformie MiSeq, z odczytami na jednym końcu 1 * 170 bp. Demultipleksowane sekwencje zostały dostarczone przez firmę zajmującą się sekwencjonowaniem (Biofidal, Lyon, Francja). Sekwencje zostały odpowiednio przycięte i adaptery usunięte przy użyciu Trimmomatic v0.39 [16]. Przycięte odczyty zostały zmapowane do sekwencji referencyjnej NC_001477.1 przy użyciu bowtie2 [17]. Geneous v9.1.8 [18] był używany do sprawdzania i weryfikowania zmapowanych danych sekwencji.

Do sekwencjonowania MinION firmy Oxford Nanopore Technology zastosowano protokół płytek amplikonu w połączeniu ze starterami DENV1 z Oxford Center for Arbovirus Discovery, Diagnostics, Genomics and Epidemiology (W skrócie, cDNA amplifikowano w dwóch niezależnych reakcjach PCR. Produkty PCR połączono, dA- ogoniasty przy użyciu modułu NEBNext® Ultra™ II End Repair/dA-Tailing Module, a następnie oznaczony kodem kreskowym przy użyciu zestawu Nanopore Native Barcoding Expansion kit (EXP-NBD104).Amplikony z kodem kreskowym zostały następnie oczyszczone przy użyciu 0,4-krotnej objętości kulek AMPure-XP SPRI, przemywając kulki z nadmiarem objętości buforu małych fragmentów Nanopore (SFB), aby upewnić się, że niezligowane cząsteczki kodu kreskowego zostały usunięte. Oczyszczone amplikony następnie połączono w równomolowe proporcje przed ligacją adaptera i sekwencjonowaniem, zgodnie z instrukcjami producenta. Cykl sekwencjonowania pozostawiono na 24 godziny i zatrzymany, gdy przewidywane pokrycie przekroczyło 1000-krotność dla każdego genomu. Wywoływanie podstawowe i demultipleksowanie przeprowadzono za pomocą guppy (v4.0.11). Wywoływanie podstawowe wykorzystywało parametry domyślne w trybie dokładnym, a demultipleksowanie przeprowadzono przy użyciu parametru „require_barcodes_both_ends”, aby zminimalizować przykładowy przesłuch. Odczyty zostały następnie zebrane przy użyciu Medaka v1.0.3 (naśladując standardową procedurę operacyjną sieci bioinformatycznej ARTIC dla sekwencjonowania SARS-CoV-2 (podpróbkowanie pokrycia amplikonu do 400x i użycie dostępu do genomu NC_001477.1 do mapowania odczytu. Do kontroli użyto Geneious v9.1.8) i wybieraj zmapowane dane sekwencji.Konsensusowe wywołanie bazy wymagało co najmniej 30-krotnego pokrycia.

W przypadku próbek z Seszeli tą metodą uzyskano tylko częściowe zespoły genomowe, ponieważ nie wszystkie pary starterów wytwarzały zamplifikowane produkty. Dane częściowego składania połączono zatem z danymi sekwencji Sangera z regionu otoczki genomu, aby wytworzyć ciągłe sekwencje konsensusowe, które obejmowały region 4838 pz na końcu 5′ genomu DENV. Region ten odpowiadał pozycjom zasad 156–4 994 genomu referencyjnego NC_001477.1 i zawierał dane genetyczne z regionów kapsydu, glikoproteiny błonowej, otoczki, NS1, NS2a i NS2b genomu.

Analiza filogenetyczna

Globalne porównania filogenetyczne przeprowadzono przy użyciu genu E, który jest zwykle używany do identyfikacji genotypów dengi [5]. Region genu E został wyodrębniony ze wszystkich sekwencji referencyjnych w bazie danych NCBI przy użyciu niestandardowych skryptów. Dopasowania zostały wygenerowane przy użyciu MAFFT [19], a wyrównanie zostało wybrane przez oko w Geneious v9.1.8. IQTree2 (v2.1.3) użyto do zidentyfikowania optymalnych parametrów modelu podstawienia i wygenerowania filogenezy o maksymalnej wiarygodności z rozruchem z 1000 powtórzeń. Reprezentacje drzewa filogenetycznego zostały wygenerowane w R, przy użyciu pakietu „ggtree”. [20].