Głównym wyzwaniem w genetyce człowieka jest zrozumienie, które części genomu kierują określonymi cechami lub przyczyniają się do ryzyka choroby. To wyzwanie jest jeszcze większe w przypadku wariantów genetycznych występujących w 98% genomu, które nie kodują białek.

Nowe podejście opracowane przez naukowców z New York University i New York Genome Center łączy badania asocjacji genetycznych, edycję genów i sekwencjonowanie pojedynczych komórek, aby sprostać tym wyzwaniom i odkryć warianty przyczynowe i mechanizmy genetyczne cech komórek krwi.

Ich podejście, nazwane STING-seq i opublikowane w Naukapodejmuje wyzwanie bezpośredniego powiązania wariantów genetycznych z cechami i zdrowiem człowieka i może pomóc naukowcom zidentyfikować cele leków dla chorób o podłożu genetycznym.

W ciągu ostatnich dwóch dekad badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) stały się ważnym narzędziem do badania ludzkiego genomu. Korzystając z GWAS, naukowcy zidentyfikowali tysiące mutacji genetycznych lub wariantów związanych z wieloma chorobami, od schizofrenii po cukrzycę, a także cechami, takimi jak wzrost. Badania te są przeprowadzane poprzez porównywanie genomów dużych populacji w celu znalezienia wariantów, które występują częściej u osób z określoną chorobą lub cechą.

GWAS może ujawnić, które regiony genomu i potencjalne warianty są zaangażowane w choroby lub cechy. Jednak te powiązania prawie zawsze występują w 98% genomu, który nie koduje białek, co jest znacznie mniej zrozumiałe niż dobrze zbadane 2% genomu, który koduje białka. Kolejną komplikacją jest to, że wiele wariantów znajduje się blisko siebie w genomie i podróżuje razem przez pokolenia, co jest koncepcją znaną jako powiązanie. Może to utrudnić odróżnienie, który wariant odgrywa prawdziwie przyczynową rolę od innych wariantów, które znajdują się w pobliżu. Nawet jeśli naukowcy mogą zidentyfikować, który wariant powoduje chorobę lub cechę, nie zawsze wiedzą, na jaki gen ten wariant wpływa.

„Głównym celem badań nad chorobami ludzkimi jest identyfikacja genów przyczynowych i wariantów, które mogą wyjaśnić mechanizmy biologiczne i określić cele leków dla tych chorób” – powiedział Neville Sanjana, profesor biologii na NYU, profesor nadzwyczajny neuronauki i fizjologii na NYU Grossman School of Medicine, główny członek wydziału w New York Genome Center i współautor badania.

„Ogromny sukces GWAS uwydatnił wyzwanie, jakim jest wydobywanie wglądu w biologię chorób z tych ogromnych zbiorów danych. Pomimo wszystkich naszych wysiłków w ciągu ostatnich 10 lat, szklanka wciąż była w najlepszym razie do połowy pełna. Potrzebowaliśmy nowego podejścia” – powiedział Tuuli Lappalainen, starszy współpracownik wydziału w New York Genome Center, profesor genomiki w Królewskim Instytucie Technologii KTH w Szwecji i współautor badania.

Lekarstwo na anemię sierpowatą

Niedawny przełom naukowy w leczeniu anemii sierpowatokrwinkowej — zaburzenia genetycznego charakteryzującego się epizodami intensywnego bólu — ilustruje, w jaki sposób połączenie GWAS z najnowocześniejszymi narzędziami molekularnymi, takimi jak edycja genów, może identyfikować warianty przyczynowe i prowadzić do innowacyjnych terapii. Korzystając z GWAS, naukowcy zidentyfikowali obszary genomu ważne dla produkcji hemoglobiny płodowej, celu opartego na obietnicy cofnięcia anemii sierpowatej, ale nie wiedzieli, który dokładnie wariant napędza jej produkcję.

Naukowcy zwrócili się do CRISPR – narzędzia do edycji genów, które według Sanjany wykorzystuje „nożyce molekularne do cięcia DNA”, aby edytować regiony zidentyfikowane przez GWAS. Kiedy dokonano edycji CRISPR w określonym miejscu w niekodującym genomie w pobliżu genu o nazwie BCL11Aspowodowało to wysoki poziom hemoglobiny płodowej.

CRISPR był obecnie używany w badaniach klinicznych do edycji tego regionu w komórkach szpiku kostnego dziesiątek pacjentów z anemią sierpowatą. Po wprowadzeniu zmodyfikowanych komórek z powrotem do pacjentów, zaczynają one wytwarzać hemoglobinę płodową, która wypiera zmutowaną dorosłą postać hemoglobiny, skutecznie lecząc ich z niedokrwistości sierpowatokrwinkowej.

„Ta historia sukcesu w leczeniu niedokrwistości sierpowatokrwinkowej jest wynikiem połączenia spostrzeżeń z GWAS z edycją genów” – powiedział Sanjana. „Ale zajęło to lata badań tylko nad jedną chorobą. Jak możemy to zwiększyć, aby lepiej zidentyfikować warianty przyczynowe i geny docelowe z GWAS?”

GWAS spełnia CRISPR i sekwencjonowanie pojedynczych komórek

Zespół badawczy stworzył przepływ pracy o nazwie STING-seq — Systematic Targeting and Inhibition of Noncoding GWAS loci z sekwencjonowaniem pojedynczych komórek. STING-seq działa poprzez pobieranie GWAS w skali biobanku i poszukiwanie prawdopodobnych wariantów przyczynowych przy użyciu kombinacji cech biochemicznych i elementów regulacyjnych. Następnie naukowcy wykorzystują CRISPR do namierzania każdego z regionów genomu związanych z GWAS i przeprowadzają sekwencjonowanie pojedynczych komórek w celu oceny ekspresji genów i białek.

W swoich badaniach naukowcy zilustrowali zastosowanie STING-seq do odkrycia docelowych genów niekodujących wariantów cech krwi. Cechy krwi — takie jak odsetek płytek krwi, białych krwinek i czerwonych krwinek — są łatwe do zmierzenia w rutynowych badaniach krwi i zostały dobrze zbadane w GWAS. W rezultacie naukowcy byli w stanie wykorzystać GWAS reprezentujący prawie 750 000 osób z różnych środowisk do badania cech krwi.

Gdy naukowcy zidentyfikowali 543 kandydujące regiony genomu, które mogą odgrywać rolę w cechach krwi, zastosowali wersję CRISPR zwaną hamowaniem CRISPR, która może wyciszyć określone regiony genomu.

Po wyciszeniu CRISPR regionów zidentyfikowanych przez GWAS, naukowcy przyjrzeli się ekspresji pobliskich genów w poszczególnych komórkach, aby sprawdzić, czy poszczególne geny są włączone, czy wyłączone. Gdyby zauważyli różnicę w ekspresji genów między komórkami, w których warianty były i nie były wyciszone, mogliby powiązać określone regiony niekodujące z docelowymi genami. W ten sposób naukowcy mogli wskazać, które regiony niekodujące są kluczowe dla określonych cech (a które nie), a często także szlaki komórkowe, przez które działają te regiony niekodujące.

„Moc STING-seq polega na tym, że możemy zastosować to podejście do dowolnej choroby lub cechy” – powiedział John Morris, doktor habilitowany w New York Genome Center i NYU oraz pierwszy autor badania.

Używanie STING-seq do testowania klastrów prawdopodobnych wariantów i obserwowania ich wpływu na geny eliminuje zgadywanie, z jakim naukowcy spotykali się wcześniej, gdy mieli do czynienia z powiązaniami między wariantami lub genami najbliższymi wariantom, które często, ale nie zawsze, są genem docelowym. W przypadku cechy krwi zwanej liczbą monocytów zastosowanie CRISPR spowodowało, że jeden gen, CD52aby wyraźnie wyróżniać się jako znacznie zmienione — i podczas gdy CD52 znajdował się blisko wariantu będącego przedmiotem zainteresowania, nie był to najbliższy gen, więc mógł zostać przeoczony przy użyciu poprzednich metod.

W innej analizie naukowcy zidentyfikowali gen o nazwie PTPRC który jest związany z 10 cechami krwi, w tym związanymi z krwinkami czerwonymi i białymi oraz płytkami krwi. Istnieje jednak kilka wariantów niekodujących zidentyfikowanych przez GWAS w bliskiej odległości i trudno było zrozumieć, które (jeśli w ogóle) mogą modulować PTPRC wyrażenie. Zastosowanie STING-seq pozwoliło im wyizolować, które warianty były przyczynowe, obserwując, które się zmieniły PTPRC wyrażenie.

STING-seq i nie tylko

Chociaż STING-seq może zidentyfikować gen docelowy i wariant przyczynowy poprzez wyciszenie wariantów, nie wyjaśnia kierunku efektu – czy określony niekodujący wariant podkręci, czy zmniejszy ekspresję pobliskiego genu. Naukowcy posunęli się o krok dalej i stworzyli komplementarne podejście, które nazwali beeSTING-seq (edycja zasad STING-seq), które wykorzystuje CRISPR do precyzyjnego wstawiania wariantu genetycznego zamiast po prostu hamowania tego regionu genomu.

Naukowcy przewidują, że STING-seq i beeSTING-seq zostaną wykorzystane do identyfikacji wariantów przyczynowych dla szerokiego zakresu chorób, które można leczyć za pomocą edycji genów – tak jak stosowano w anemii sierpowatej – lub za pomocą leków ukierunkowanych na określone geny lub szlaki komórkowe.

„Teraz, gdy możemy połączyć niekodujące warianty z docelowymi genami, daje nam to dowód, że można opracować terapie małymi cząsteczkami lub przeciwciałami, aby zmienić ekspresję określonych genów” – powiedział Lappalainen.

Dodatkowi autorzy badań to Christina Caragine, Zharko Daniloski, Lu Lu i Kyrie Davis z NYU i New York Genome Center; Júlia Domingo, Marcello Ziosi, Dafni Glinos, Stephanie Hao, Eleni P. Mimitou i Peter Smibert z New York Genome Center; Timothy Barry i Kathryn Roeder z Carnegie Mellon University; i Eugene Katsevich z University of Pennsylvania.

Badania były wspierane przez Narodowe Instytuty Zdrowia (DP2HG010099, R01CA279135, R01CA218668, R01AI176601, R01MH106842, UM1HG008901, R01GM122924, K99HG012792, R01MH123184), Narodową Fundację Nauki (DMS-2 113072), Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem, European Molecular Biology Organization (ALTF 345-2021), American Heart Association (20POST35220040), Simons Foundation for Autism Research, MacMillan Center for the Study of the Non-Coding Cancer Genome, Wharton Data Science and Business Analytics Fund, New York University oraz Centrum Genomu w Nowym Jorku.