CRISPR i sekwencjonowanie pojedynczych komórek podkreślają warianty genetyczne cech i chorób
W tym artykule zwrócono uwagę na nowe podejście do genetyki człowieka, wykorzystujące STING-seq, które zapewnia mapę drogową do identyfikacji wariantów i genów, umożliwiając głębsze zrozumienie niekodującego genomu i celów terapii
Nowe podejście opracowane przez naukowców z New York University (NYU) i New York Genome Centre w USA łączy badania asocjacji genetycznych, edycję genów i sekwencjonowanie pojedynczych komórek w celu sprostania wyzwaniom genetycznym człowieka i odkrycia wariantów przyczynowych i mechanizmów genetycznych komórek krwi cechy.
Ich podejście, nazwane STING-seq, opublikowane w Naukapodejmuje wyzwanie bezpośredniego powiązania wariantów genetycznych z cechami i zdrowiem człowieka i może pomóc naukowcom zidentyfikować cele leków dla chorób o podłożu genetycznym.
Korzystając z badań asocjacyjnych całego genomu (GWAS), naukowcy zidentyfikowali tysiące genetycznych mutacji lub wariantów związanych z wieloma chorobami, od schizofrenii po cukrzycę, a także cechami, takimi jak wzrost. Badania te są przeprowadzane poprzez porównywanie genomów dużych populacji w celu znalezienia wariantów, które występują częściej u osób z określoną chorobą lub cechą.
„Głównym celem badań nad chorobami ludzkimi jest identyfikacja genów przyczynowych i wariantów, które mogą wyjaśnić mechanizmy biologiczne i określić cele leków dla tych chorób” – powiedział Neville Sanjana, profesor biologii na NYU, profesor nadzwyczajny neurologii i fizjologii w NYU Grossman School of Medicine, główny członek wydziału w New York Genome Centre i współautor badania.
Lekarstwo na anemię sierpowatą
Niedawny przełom naukowy w leczeniu anemii sierpowatokrwinkowej — zaburzenia genetycznego charakteryzującego się epizodami intensywnego bólu — ilustruje, w jaki sposób połączenie GWAS z najnowocześniejszymi narzędziami molekularnymi, takimi jak edycja genów, może identyfikować warianty przyczynowe i prowadzić do innowacyjnych terapii. Korzystając z GWAS, naukowcy zidentyfikowali obszary genomu ważne dla produkcji hemoglobiny płodowej, celu opartego na obietnicy cofnięcia anemii sierpowatokrwinkowej, ale nie wiedzieli, który dokładnie wariant napędza jej produkcję.
Naukowcy zwrócili się do CRISPR – narzędzia do edycji genów, które według Sanjany wykorzystuje „nożyce molekularne do cięcia DNA”, aby edytować regiony zidentyfikowane przez GWAS. Kiedy dokonano edycji CRISPR w określonym miejscu w niekodującym genomie w pobliżu genu o nazwie BCL11Aspowodowało to wysoki poziom hemoglobiny płodowej.
CRISPR był obecnie używany w badaniach klinicznych do edycji tego regionu w komórkach szpiku kostnego dziesiątek pacjentów z anemią sierpowatokrwinkową. Po tym, jak zmodyfikowane komórki zostaną z powrotem podane pacjentom, zaczynają wytwarzać hemoglobinę płodową, która wypiera zmutowaną dorosłą postać hemoglobiny, skutecznie lecząc ich z niedokrwistości sierpowatokrwinkowej.
„Ta historia sukcesu w leczeniu niedokrwistości sierpowatokrwinkowej jest wynikiem połączenia spostrzeżeń z GWAS z edycją genów” – dodał Sanjana. „Ale zajęło to lata badań tylko nad jedną chorobą. Jak możemy to zwiększyć, aby lepiej zidentyfikować warianty przyczynowe i geny docelowe z GWAS?”
GWAS spełnia CRISPR i sekwencjonowanie pojedynczych komórek
Zespół badawczy stworzył przepływ pracy o nazwie STING-seq — Systematic Targeting and Inhibition of Noncoding GWAS loci z sekwencjonowaniem pojedynczych komórek. STING-seq działa poprzez pobieranie GWAS w skali biobanku i poszukiwanie prawdopodobnych wariantów przyczynowych przy użyciu kombinacji cech biochemicznych i elementów regulacyjnych. Następnie naukowcy wykorzystują CRISPR do namierzania każdego z regionów genomu związanych z GWAS i przeprowadzają sekwencjonowanie pojedynczych komórek w celu oceny ekspresji genów i białek.
W swoich badaniach naukowcy zilustrowali zastosowanie STING-seq do odkrycia docelowych genów niekodujących wariantów cech krwi. Cechy krwi — takie jak odsetek płytek krwi, białych krwinek i czerwonych krwinek — są łatwe do zmierzenia w rutynowych badaniach krwi i zostały dobrze zbadane w GWAS. W rezultacie naukowcy byli w stanie wykorzystać GWAS reprezentujący prawie 750 000 osób z różnych środowisk do badania cech krwi.
Gdy naukowcy zidentyfikowali 543 kandydujące regiony genomu, które mogą odgrywać rolę w cechach krwi, zastosowali wersję CRISPR zwaną hamowaniem CRISPR, która może wyciszyć określone regiony genomu.
Po wyciszeniu CRISPR regionów zidentyfikowanych przez GWAS, naukowcy przyjrzeli się ekspresji pobliskich genów w poszczególnych komórkach, aby sprawdzić, czy poszczególne geny są włączone, czy wyłączone. Gdyby zauważyli różnicę w ekspresji genów między komórkami, w których warianty były i nie były wyciszone, mogliby powiązać określone regiony niekodujące z docelowymi genami. W ten sposób naukowcy mogli wskazać, które regiony niekodujące są kluczowe dla określonych cech (a które nie), a często także szlaki komórkowe, przez które działają te regiony niekodujące.
„Moc STING-seq polega na tym, że możemy zastosować to podejście do dowolnej choroby lub cechy” – powiedział John Morris, doktor habilitowany w New York Genome Center i NYU oraz pierwszy autor badania.
Używanie STING-seq do testowania klastrów prawdopodobnych wariantów i obserwowania ich wpływu na geny eliminuje zgadywanie, z jakim naukowcy spotykali się wcześniej, gdy mieli do czynienia z powiązaniami między wariantami lub genami najbliższymi wariantom, które często, ale nie zawsze, są genem docelowym. W przypadku cechy krwi zwanej liczbą monocytów zastosowanie CRISPR spowodowało, że jeden gen, CD52aby wyraźnie wyróżniać się jako znacznie zmienione — i podczas gdy CD52 znajdował się blisko wariantu będącego przedmiotem zainteresowania, nie był to najbliższy gen, więc mógł zostać przeoczony przy użyciu poprzednich metod.
W innej analizie naukowcy zidentyfikowali gen o nazwie PTPRC który jest związany z 10 cechami krwi, w tym związanymi z krwinkami czerwonymi i białymi oraz płytkami krwi. Istnieje jednak kilka wariantów niekodujących zidentyfikowanych przez GWAS w bliskiej odległości i trudno było zrozumieć, które (jeśli w ogóle) mogą modulować PTPRC wyrażenie. Zastosowanie STING-seq pozwoliło im wyizolować, które warianty były przyczynowe, obserwując, które się zmieniły PTPRC wyrażenie.
STING-seq i nie tylko
Chociaż STING-seq może zidentyfikować gen docelowy i wariant przyczynowy poprzez wyciszenie wariantów, nie wyjaśnia kierunku efektu – czy określony niekodujący wariant podkręci, czy zmniejszy ekspresję pobliskiego genu. Naukowcy posunęli się o krok dalej i stworzyli komplementarne podejście, które nazwali beeSTING-seq (edycja zasad STING-seq), które wykorzystuje CRISPR do precyzyjnego wstawiania wariantu genetycznego zamiast po prostu hamowania tego regionu genomu.
Naukowcy wyobrażają sobie, że STING-seq i beeSTING-seq zostaną wykorzystane do identyfikacji wariantów przyczynowych dla szerokiego zakresu chorób, które można leczyć za pomocą edycji genów – tak jak stosowano w anemii sierpowatokrwinkowej – lub za pomocą leków ukierunkowanych na określone geny lub szlaki komórkowe.
„Teraz, gdy możemy połączyć niekodujące warianty z docelowymi genami, daje nam to dowód, że można opracować terapie małymi cząsteczkami lub przeciwciałami, aby zmienić ekspresję określonych genów” – podsumowuje Tuuli Lappalainen, starszy członek wydziału w New York Genome Centre, Profesor genomiki w Królewskim Instytucie Technologii KTH w Szwecji i współautor badania.