Najnowocześniejsze technologie i podejścia naukowe, które mogą uzupełnić wykorzystanie eksperymentalnych modeli ssaków w badaniach, wykazały w ostatnich latach ogromny postęp, częściowo dzięki wysiłkom liderów z NIEHS i innych osób zajmujących się naukami o zdrowiu środowiskowym. Narzędzia te, nazywane metodologiami nowego podejścia (NAM), obejmują uczenie maszynowe i in vitro [cell-based] od systemów chemicznych po wielkoseryjne ekrany chemiczne i zaawansowane techniki obliczeniowe, które pomagają naukowcom integrować i interpretować duże ilości danych toksykologicznych.

Jednym z rodzajów NAM, który moim zdaniem mógłby pomóc zmienić naszą zdolność rozumienia narażenia środowiskowego i jego potencjalnych skutków biologicznych, jest tak naprawdę niewielki gatunek inny niż ssaki – danio pręgowany. Na początku stycznia wziąłem udział w konferencji na temat zdrowia środowiskowego w Indiach, której gospodarzem był Krajowy Instytut Badawczy Inżynierii Środowiska, będący częścią tamtejszej Rady ds. Badań Naukowych i Przemysłowych. Laureatka grantu NIEHS, doktor Robyn Tanguay z Oregon State University (OSU), omówiła między innymi swoje wykorzystanie danio pręgowanego i dlaczego jej zdaniem reprezentuje on zmianę paradygmatu w badaniach toksykologicznych.

Po konferencji spotkałem się z dr Tanguay, która kieruje także wspieranym przez NIEHS Centrum Badawczym Superfund w OSU, aby dowiedzieć się więcej o jej portfolio naukowym i lepiej zrozumieć, co sprawia, że ​​danio pręgowany jest organizmem modelowym potencjalnie zmieniającym reguły gry. Omówiliśmy, w jaki sposób danio pręgowany może pomóc naukowcom w badaniu wielu substancji chemicznych jednocześnie, ocenie skutków interakcji gen-środowisko, ustalaniu priorytetów substancji do badania na tradycyjnych modelach zwierzęcych i rzucić światło na krytyczne mechanizmy biologiczne, które mogą zostać zmienione w wyniku narażenia. Zapytałem także dr Tanguay o to, co zainspirowało ją do zostania naukowcem.

Korzyści badawcze danio pręgowanego

Ricka Woychika: Dlaczego danio pręgowany jest idealnym modelem do badania potencjalnych skutków zdrowotnych narażenia środowiskowego?

Robyn Tanguay: Podobieństwa genetyczne między danio pręgowanym a ludźmi są niezwykłe, ponieważ geny niezbędne do stworzenia człowieka są podobne do tych niezbędnych do stworzenia ryby. Wykorzystując to podobieństwo i inne cechy danio pręgowanego, badacze mogą wykorzystać ten organizm modelowy na ważne sposoby, w tym w celu szybszej identyfikacji narażenia, które ma wpływ na jego interakcję z naszą strukturą genetyczną i biologiczną.

Danio pręgowany pochodzi z Indii i ma różne boczne paski przypominające zebrę. Dorosłe osobniki mają około jednego cala długości, ale tak naprawdę większość pracy wykonujemy na etapie rozwoju embrionalnego, kiedy mówimy wtedy o długości milimetrów. Na tym wczesnym etapie życia są przezroczyste, więc za pomocą prostego i niedrogiego mikroskopu można faktycznie obserwować rozwój mózgu, serca, oczu, uszu itd. Między innymi dzięki temu można łatwo zobaczyć, jak narażenie może wpłynąć na rozwój danego narządu.

Kolejną ważną zaletą badania danio pręgowanego jest szybkość jego rozwoju. Możemy zacząć pewnego ranka od pojedynczej komórki, a do południa następnego dnia serce już bije, a wiele innych układów narządów powstaje już po dwóch dniach. Pozwala to na znacznie większą szybkość i efektywność naszych badań, niż jest to możliwe w tradycyjnych systemach na gryzoniach. Szybki rozwój danio pręgowanego — w połączeniu z różnymi możliwościami obrazowania i narzędziami do analizy genetycznej, którymi dysponujemy — pozwala na dokonywanie ekscytujących odkryć na dużą skalę i niskim kosztem.

Co ważne, prawie każdy gen zakodowany w organizmie ma za zadanie wykonać zadanie lub wiele zadań na wczesnym etapie rozwoju. Czasami gen jest potrzebny jedynie przejściowo do wykonania zadania rozwojowego, a potem być może w późniejszym życiu odgrywa ważną rolę na przykład w wątrobie dorosłego człowieka. Wiemy jednak, że prawie wszystkie geny ulegają ekspresji i są aktywne podczas rozwoju embrionalnego. Jest to zatem idealny moment, aby sprawdzić, czy substancja chemiczna zaburza funkcjonowanie genów i powoduje obserwowalne zmiany fizyczne, które można powiązać z wynikiem choroby.

Przełom w ocenie neurobehawioralnej

RW: Przez lata Wasze laboratorium wykorzystywało danio pręgowanego do badania potencjalnego wpływu na zdrowie substancji chemicznych, takich jak wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, środki zmniejszające palność, pestycydy i złożone mieszaniny. Czy możesz rozwinąć tę pracę dla naszych czytelników?

CZ: Jasne. Najpierw staraliśmy się obserwować normalny przebieg rozwoju danio pręgowanego, aby zrozumieć ich podstawowe cechy fizyczne i cechy behawioralne. Może to obejmować tętno, średnicę oczu, krzywiznę ciała i tak dalej. Następnie zaczęliśmy robić ekspozycje przy użyciu poszczególnych substancji chemicznych z różnych klas, takich jak dioksyny, metale i inne, o których wspomniałeś. Celem było zidentyfikowanie wszystkich nieprawidłowych fenotypów powstałych w wyniku narażenia, a następnie zgłębienie tematu poprzez analizę zaangażowanych mechanizmów genetycznych i biologicznych.

Od razu zauważyliśmy, że wiele różnych substancji chemicznych powoduje powszechne skutki fizyczne i behawioralne, takie jak obrzęk serca [swelling caused by buildup of fluid]. Informacje te same w sobie nie dały nam dużego wglądu w potencjalne mechanizmy, ale pokazały wartość naszego modelu w badaniu zmian fizycznych i behawioralnych spowodowanych różnymi ekspozycjami, co pomogłoby ustalić priorytety naszych działań następczych oceny.

Odkryliśmy także, że danio pręgowany można wykorzystać do badania efektów neurobehawioralnych na dużą skalę, co wcześniej nie było możliwe i stanowi spore wyzwanie w modelach komórkowych. Oznaczało to, że mogliśmy szybko ocenić zmiany w rozwoju układu nerwowego, zmiany w aktywności motorycznej i nie tylko. Następnie staraliśmy się przeprowadzić zintegrowane oceny, w ramach których zmierzyliśmy wszystkie fenotypy w ciągu kilku dni, w wielu stężeniach. Wiele wczesnych innowacji mojej grupy w tej dziedzinie powstało dzięki funduszom NIEHS, kiedy stanęliśmy przed wyzwaniem zrobienia czegoś, co mogłoby reprezentować zmianę paradygmatu w tej dziedzinie. Myślę, że nasza praca przyniosła taki efekt i jestem wdzięczny za to wsparcie.

Śledzenie przyczyny i skutku

RW: W jaki sposób Twój zespół próbował przejść od identyfikacji fenotypu do lepszego zrozumienia mechanizmów genetycznych i biologicznych, które mogą to powodować? I jak taką wiedzę można przełożyć na ludzkie konteksty?

CZ: W dziedzinie oceny ryzyka toksykologicznego wzrasta zainteresowanie identyfikacją zmian w ekspresji genów, które pozwalają przewidzieć wynik choroby, a następnie określeniem, jaki poziom narażenia jest powiązany z tym skutkiem. To jest ten sam rodzaj wiedzy naukowej, który staramy się zdobyć pracując z danio pręgowanym. Stosujemy transkryptomikę [large-scale assessment of gene expression changes in an organism] w celu określenia, jakie zmiany genetyczne mogą wynikać z niższych poziomów narażenia, które bardziej przypominają te, których ludzie mogą doświadczyć w życiu codziennym.

Kiedy zidentyfikujemy te zmiany w ekspresji genów, możemy spróbować zobaczyć, które zmiany mają charakter adaptacyjny, a które nie. Jako ludzie jesteśmy cały czas narażeni na działanie różnych substancji, ale nasze ciała reagują adaptacyjnie, zmieniając metabolizm lub eliminując substancję chemiczną, po czym przywracana jest homeostaza. Choroba zaczyna się wtedy, gdy osiągasz punkty krytyczne – kiedy zakłócasz zbyt wiele genów lub modulujesz aktywność procesu genetycznego i zmieniasz homeostazę.

Przyglądając się ekspozycji, które zarówno wpływają na ekspresję genów, jak i wytwarzają fenotypy, mamy nadzieję zidentyfikować związek przyczynowy – pokazujący, że narażenie nie tylko spowodowało fenotyp, ale także, że fenotyp wynikał z określonego mechanizmu genetycznego. Technologie edycji genów, którymi dysponujemy, pozwalają nam solidnie przetestować, jakie aspekty krajobrazu genetycznego mogą odgrywać rolę w obserwowanym przez nas fenotypie. Ponadto, ze względu na mały rozmiar i przezroczystość danio pręgowanego, możemy w czasie rzeczywistym obserwować, jak komórki oddziałują ze sobą po ekspozycji i zmianie ekspresji genów, co dodatkowo pomaga w naszej analizie.

Jeśli chodzi o wykorzystanie wiedzy zdobytej w badaniach danio pręgowanego w kontekście podejmowania decyzji, wiem, że organy regulacyjne otrzymują obecnie dane dotyczące danio pręgowanego w ramach swoich pakietów informacyjnych. Ściśle współpracowałem z EPA [U.S. Environmental Protection Agency] i FDA [U.S. Food and Drug Administration] aby pomóc im poczuć się bardziej komfortowo z tym nowym typem strumienia danych. Dane dotyczące konkretnego narażenia w modelu danio pręgowanego postrzegam jako studium przypadku, dzięki któremu możemy zidentyfikować korelacje z tradycyjnymi danymi badawczymi i, co ważniejsze, spróbować zrozumieć, dlaczego mogą występować rozbieżności, co mogłoby pomóc w wzmocnieniu stosowania tego modelu. Jestem pewien, że w przyszłości dane dotyczące danio pręgowanego zostaną wykorzystane przez decydentów do podejmowania bardziej świadomych wyborów, które mogą mieć lepszy wpływ na zdrowie publiczne.

Rzucanie światła na PFAS

RW: Skoro mowa o narażeniu istotnym dla człowieka, rozumiem, że pańskie laboratorium zaczęło badać substancję, która w ostatnich latach pojawiała się na pierwszych stronach gazet – substancje per- i polifluoroalkilowe, czyli PFAS. Czy możesz podzielić się fragmentem swojej początkowej pracy w tej dziedzinie?

CZ: Różnorodność tych struktur jest niezwykła. Sprawdziliśmy ich setki w naszym systemie danio pręgowanego i mogę powiedzieć, że absolutnie nie zachowują się w ten sam sposób. Niektóre mogą ulegać bioakumulacji, ale inne nie, a niektóre są metabolizowane, podczas gdy inne są aktywne w niskich stężeniach. Próbujemy więc wykorzystać nasz model, aby lepiej zrozumieć cechy tych substancji chemicznych, które czynią je mniej lub bardziej niebezpiecznymi.

Chcemy zidentyfikować PFAS, które ulegają bioakumulacji i mają określone cele biologiczne, którymi są najstraszniejsze rodzaje cząsteczek. Substancje, które ulegają bioakumulacji, ale nie mają określonych celów, mogą stanowić problem w przypadku długotrwałego narażenia, ale nie martwię się nimi tak bardzo, jak tymi, które uderzają w cel biologiczny i modulują go. Mamy nadzieję, że nasz system danio pręgowanego pomoże ustalić priorytety, które PFAS mogą być bezpieczne w użyciu, a które należy wyeliminować.

[To learn more about Tanguay’s zebrafish research and recent publications, please visit her laboratory’s website.]