Chociaż pierwszy lek CRISPR — Casgevy, terapia CRISPR-Cas9, wcześniej znana jako exa-cel opracowana przez Vertex Pharmaceuticals i CRISPR Therapeutics — została zatwierdzona w Wielkiej Brytanii do leczenia anemii sierpowatokrwinkowej, poszukiwania udoskonalonych edytorów genów są dalekie od zakończenia .

Aby zminimalizować efekty niepożądane, naukowcy z Uniwersytetu Wuhan przetestowali nowe podejście do edycji genów za pomocą edytora baz „transformatorowych” (tBE), aby zoptymalizować tę samą strategię terapeutyczną, którą stosował Casgevy w leczeniu anemii sierpowatokrwinkowej i innych β-hemoglobinopatii, takich jak β-talasemia . tBE posiada mechanizm przypominający bezpiecznik, który powoduje wyłączenie edytora po wykonaniu edycji, umożliwiając edycję w miejscu docelowym, jednocześnie znacznie ograniczając edycję poza celem. Wykorzystanie tBE w podejściu do edycji genów zastosowanej przez Casgevy’ego zaowocowało niewykrywalnymi efektami odbiegającymi od docelowych i trwałymi hematopoetycznymi komórkami macierzystymi (HSC), które zawierały edycję, co stanowi bezpieczną i skuteczną strategię leczenia β-hemoglobinopatii.

Recenzowany artykuł naukowy „Edycja bazy promotora HBG indukuje silną ekspresję hemoglobiny płodowej bez wykrywalnych mutacji poza celem w ludzkich HSC” ukazało się w Komórka Komórka Macierzysta.

tBE w przypadku β-hemoglobinopatii

Mutacje locus genu podjednostki beta hemoglobiny (HBB), które upośledzają poziom hemoglobiny u dorosłych (HbA) poprzez hamowanie wytwarzania β-globiny, są częstą przyczyną β-hemoglobinopatii. Istnieją różne strategie edycji genów w celu zaradzenia zaburzonej produkcji β-globiny. Jedna ze strategii opiera się na zastąpieniu poziomu HbA poziomami hemoglobiny płodowej (HbF) w hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych (HSPC) poprzez przywrócenie ekspresji γ-globiny, która jest ściśle regulowana przez cały okres rozwoju i jest wyciszana wkrótce po urodzeniu przez represory wiążące się z jej promotorem regionach do poziomu terapeutycznego.

Czynnik transkrypcyjny A BCL11 (BCL11A) oraz palec cynkowy i domena BTB 7A (ZBTB7A) są dwoma głównymi represorami ekspresji genu γ-globiny, odpowiedzialnymi za jego wyciszanie. Mutowanie tych motywów wiążących zlokalizowanych w regionie regulatorowym locus HBG jest jednym ze sposobów reaktywacji ekspresji γ-globiny. Casgevy robi to poprzez zastosowanie nukleazy Cas9 do zakłócenia motywów wiązania represora w HSPC, co polega na generowaniu pęknięć dwuniciowych, a tym samym stwarza ryzyko reakcji na uszkodzenie DNA i toksyczność komórkową w HSPC.

Edytory zasad cytozynowych lub adeninowych (CBE lub ABE) mogą konwertować zmiany zasad C-na-T lub A-na-G bez generowania DSB. Poprzednie badania z wykorzystaniem edytorów podstawowych ukierunkowanych na motywy regulacyjne skutecznie indukowały ekspresję γ-globiny. Jednak analizując zdarzenia poza celem, zarówno CBE, jak i ABE wywołały dużą aktywność poza celem, co wzbudziło poważne obawy dotyczące bezpieczeństwa.

Naukowcy z Uniwersytetu Wuhan bezpośrednio porównali edycję tBE ​​w HSPC pod kątem indukcji HbF z innymi strategiami edycji klinicznej lub przedklinicznej przy użyciu nukleazy Cas9 lub konwencjonalnych edytorów zasad, takich jak hA3A-BE3, BE4max, CE1048-1063-CBE i A3A(N57Q)-BE3. Aby dostarczyć tBE do komórek, naukowcy wybrali metodę dostarczania mRNA z roztworem izotonicznym zamiast elektroporacji, co może mieć wpływ na wydajność dostarczania i zdrowie komórek. W porównaniu z innymi podejściami, motyw wiążący BCL11A zmodyfikowany tBE indukował wyższy poziom HbF niż inne, a edycja trwała w ponownie zaludnionych komórkach macierzystych. In vitro a testy wiązania komórkowego ujawniły, że motyw TGATTA wygenerowany przez tBE całkowicie zniósł jego interakcję z BCL11A. Profile DNA i RNA nie wykazywały wykrywalnych mutacji poza celem w komórkach poddanych edycji tBE.

Badanie to pokazuje, że oparta na tBE edycja miejsca wiązania BCL11A w promotorze HBG1/2 była silnym i bardzo skutecznym sposobem na ponowne włączenie HbF w ludzkich HSC. Pokazuje również, że możliwe jest dostarczanie mRNA o niewielkiej aktywności poza celem, co jest mocnym powodem, aby kontynuować rozwój kliniczny tBE w autologicznych HSC jako możliwego leku na β-hemoglobinopatie.