NOWY JORK – Szwedzki startup Pixelgen Technologies ma na celu umożliwienie nowego wymiaru analizy białek jednokomórkowych, rozpoczynając sprzedaż swojego nowego narzędzia do proteomiki przestrzennej.

Firmowy zestaw proteomiki przestrzennej pojedynczej komórki (SCSP) umożliwia naukowcom określenie zarówno ilości, jak i lokalizacji 76 celów białkowych na powierzchni pojedynczych komórek. Według użytkownika Pettera, który uzyskał wcześniejszy dostęp Brodin, profesor immunologii w Karolinska Institute i Imperial College London, technologia Pixelgen umożliwia badanie lokalizacji i grupowania białek powierzchniowych komórek z poziomami multipleksowania i przepustowości, które wcześniej nie były możliwe.

Zestaw SCSP wykorzystuje odmianę technologii testu rozszerzenia bliskości (PEA) opracowanej przez firmę proteomiczną Olink, w której współzałożyciel i dyrektor generalny Pixelgen, Simon Fredriksson, był wcześniej współzałożycielem, dyrektorem generalnym i CSO.

GROSZEK wykorzystuje pary przeciwciał połączonych z niciami DNA, które zbliżają się do siebie, gdy przeciwciała wiążą się z celem. DNA jest następnie wydłużane przez polimerazę, która tworzy nową sekwencję, która może być użyta jako marker zastępczy dla białka docelowego.

Pixelgen podobnie wykorzystuje przeciwciała znakowane DNA do wykrywania i oznaczania ilościowego docelowych białek, ale wykorzystuje wydłużanie tych nici DNA do lokalizacji tych białek na powierzchni komórki. Proces rozpoczyna się od inkubacji utrwalonych pojedynczych komórek z przeciwciałami znakowanymi kwasem nukleinowym dla białek powierzchniowych komórki będących przedmiotem zainteresowania. Następnie użytkownicy traktują komórkę kawałkami DNA zawierającymi sekwencje przeznaczone do fuzji ze znacznikiem DNA na przeciwciele. Ostatni etap testu wykorzystuje wydłużenie, aby połączyć ze sobą wszystkie te piksele DNA, tworząc siatkę znaczników DNA, która pozwala naukowcom zidentyfikować zarówno białka obecne na powierzchni komórki, jak i gdzie na komórce się znajdują. Odczyt tej siatki odbywa się za pomocą sekwencjonowania nowej generacji na instrumentach Illumina.

Naukowcy od dawna wiedzą, że przestrzenna organizacja białek na powierzchni komórki jest ważna dla funkcjonowania komórki, ale badanie tego wymiaru przestrzennego było wyzwaniem, powiedział Brodin.

„Istnieje wiele publikacji pokazujących, że tego typu adaptacje – przestrzenna lokalizacja białek, polaryzacja białek w kierunku komórki docelowej lub powierzchni, po której porusza się komórka, segregacja różnych białek na różnych końcach komórki – wszystkie te rzeczy dzieją się z jakiegoś powodu” – powiedział.

Zazwyczaj naukowcy badali te informacje przestrzenne za pomocą metod obrazowania fluorescencyjnego, takich jak cytometria obrazowa, w której białka powierzchniowe komórki będące przedmiotem zainteresowania są znakowane przeciwciałami znakowanymi fluorescencyjnie, a następnie fotografowane podczas przepuszczania przez cytometr przepływowy. Jednak takie eksperymenty są zazwyczaj ograniczone do 10 lub mniej celów białkowych, powiedział Brodin.

Technologia Pixelgen ma znacznie większe możliwości multipleksowania. Podczas gdy początkowy zestaw SCSP celuje w 76 białek, Brodin powiedział, że celowanie w setki białek jest wykonalne.

Pierwszym wydaniem zestawu SCSP firmy Pixelgen jest Immunology Panel 1, Human, który, jak sama nazwa wskazuje, celuje w ludzkie białka, które są szczególnie interesujące dla badaczy immunologii. Fredriksson powiedział, że ten początkowy panel 76 celów ma na celu przede wszystkim pokrycie ważnych białek na komórkach T, komórkach B, komórkach NK i makrofagach.

„Odtąd będziemy się rozwijać”, powiedział, dodając, że na powierzchni komórek odpornościowych „jest prawdopodobnie około 500 do 600 bardzo interesujących białek, które chciałbyś zbadać”.

Fredriksson powiedział, że zestawy SCSP mają obsługiwać około 1000 komórek na eksperyment. Powiedział, że przepustowość będzie w dużej mierze zależeć od zdolności sekwencjonowania użytkownika.

W BioRxiv preprint opublikowany w tym miesiącu, naukowcy Pixelgen wraz z Brodinem, który jest członkiem naukowej rady doradczej firmy, wykorzystali tę technologię do badania wzorców lokalizacji białek w limfocytach T stymulowanych przez chemokiny. Przyjrzeli się w szczególności powstawaniu uropodów, formacji białkowej, która, jak zauważyli, jest „krytyczna dla cytotoksycznych komórek T w infiltracji guzów” i „jest związana ze skutecznością hamowania immunologicznego punktu kontrolnego i całkowitym przeżyciem raka”.

Technologia SCSP zwraca wyniki w trzech wymiarach: obfitość białka; polaryzacja białka, co oznacza, czy dane białko jest skupione w określonych miejscach w komórce; oraz kolokalizacja białek, co oznacza, w jaki sposób różne białka skupiają się razem w komórce. Naukowcy zidentyfikowali 12 białek o różnej liczebności w stymulowanych komórkach w porównaniu z komórkami kontrolnymi, 15 z różnymi wynikami polaryzacji i 15 z różnicami w kolokalizacji. Białka te obejmowały szereg białek, w tym CD2, CD44, CD50 i CD162, o których wiadomo, że biorą udział w tworzeniu uropodów z komórek T.

Brodin powiedział, że jego laboratorium stosuje teraz różne bodźce do różnych typów komórek odpornościowych i wykorzystuje technologię do obserwowania, jak białka zmieniają się w obfitości lub lokalizacji w odpowiedzi. Powiedział, że takie zjawiska są słabo poznane ze względu na brak narzędzi do ich badania.

„Moim zdaniem jest to szeroko otwarte terytorium” – powiedział. „Wierzymy, że zaistnieją warunki, w których doda to informacje, które wcześniej przegapiliśmy i które pozwolą nam lepiej zrozumieć mechanistycznie, co się dzieje”.

Zasugerował szereg obszarów, w których zestawy SCSP mogą okazać się przydatne, na przykład w badaniu odpowiedzi przeciwnowotworowych komórek odpornościowych i zmodyfikowanych komórek odpornościowych, takich jak limfocyty T CAR, lub w jaki sposób komórki odpornościowe dostosowują się i przestawiają swoją architekturę białek w czasie.

„Myślę, że można z tego wyciągnąć ogromną ilość informacji” – powiedział Brodin.

Dodał, że postrzega tę technologię jako interesujące nowe uzupełnienie innych narzędzi do analizy białek jednokomórkowych, takich jak cytometria mas i CITE-Seq, z których korzysta jego laboratorium. Zasugerował, że te ostatnie narzędzia zaczęły osiągać punkt malejących zwrotów pod względem multipleksowania białek.

„Z naszego doświadczenia wynika, że ​​posiadanie 100, 150 lub 200 białek nie robi wielkiej różnicy” – powiedział. „Jesteś w pewnym sensie nasycony, gdy osiągnąłeś naprawdę szczegółowy obraz różnych [cell] obecne populacje. Myślę, że spokojnie możesz mieć 50 [proteins], Szczerze mówiąc. To, co robimy z tą technologią, to w rzeczywistości dodawanie nowych wymiarów, których wcześniej nie mieliśmy”.

Fredriksson powiedział, że użytkownicy Pixelgena z wczesnym dostępem wykorzystują technologię przede wszystkim do podstawowych badań nad reakcjami komórek odpornościowych na bodźce, tak jak zrobiła to grupa Brodina, oraz do prac nad rozwojem leków badających sposób działania leku na komórki odpornościowe.

Pixelgen zaczął przyjmować zamówienia na zestawy SCSP i planuje rozpocząć ich wysyłkę we wrześniu lub październiku tego roku.

Firma, która obecnie zatrudnia 25 pracowników, zebrała mniej więcej 6 milionów dolarów na finansowanie zalążkowe ostatni rok. Fredriksson odmówił powiedzenia, czy planuje zebrać dodatkowe fundusze na wsparcie uruchomienia zestawu SCSP.