Naukowcy zidentyfikowali kompaktową wersję białka edytującego geny, która jest wystarczająco mała, aby zmieścić się w wirusach związanych z adenowirusami (AAV) i którą można modyfikować w celu zapewnienia wysoce skutecznej, ukierunkowanej terapii dla komórek.

Stosunkowo mała wersja białka Cas12a związanego z CRISPR występuje naturalnie w Erysipelotrichia klasa bakterii i nosi nazwę EbCas12a.

Jego rozmiar umożliwia Cas12a wraz z RNA CRISPR dopasowanie się do niepatogennych wirusów, które są powszechnie stosowane w terapii genowej, gdy w przeciwnym razie byłyby zbyt duże.

Naukowcy dodali ponadto mutację punktową, aby stworzyć wariant białka o wysokiej aktywności, który nazwali wzmocnionym (en)EbCas12a.

„Podsumowując, enEbCas12a zapewnia obiecujące narzędzie do edycji genomu i potężną platformę dla terapii genowej AAV” – poinformował dr Hongjian Wang z Uniwersytetu Wuhan wraz ze współpracownikami na łamach czasopisma Biologia PLOS.

CRISPR to naturalnie występujący system używany przez bakterie do rozpoznawania i obrony przed inwazją wirusów. Zostało zaadaptowane jako narzędzie do edycji genetycznej, w którym białka Cas powiązane z CRISPR służą jako nożyczki molekularne do wycinania kodu genetycznego.

Następnie można dostarczyć szablon DNA w celu naprawy wadliwego genu lub wstawienia nowego, przy czym system wykazuje potencjał w zakresie korygowania chorób genetycznych, takich jak anemia sierpowatokrwinkowa i mukowiscydoza.

AAV zostały już z powodzeniem wdrożone w badaniach klinicznych w celu zapewnienia terapii genowej i w przeciwieństwie do plazmidowego DNA i rybonukleoprotein, które mogą ulec degradacji in vivo po kilku dniach, system dostarczania zapewnia długotrwałą obecność dostarczonego materiału genetycznego.

Jednakże AAV mają małą pojemność pakowania wynoszącą 4,7 kb lub mniej, co ogranicza ich zastosowania kliniczne w systemie dostarczania genów CRISPR/Cas. W szczególności Cas12a jest zbyt duży, aby można go było zamknąć w CRISPR (cr) RNA.

„Aby zastosować Cas12a w terapii genowej AAV, pilnie potrzebne są małe Cas12a, które można spakować wraz z crRNA w pojedynczy AAV” – twierdzą naukowcy.

W serii eksperymentów odkryli, że zwarte białko EbCas12a wykazuje aktywność rozszczepiania DNA in vitro, a także wykazywało szerokie działanie w zakresie edycji genów w komórkach ssaków.

Wprowadzenie kluczowej mutacji (D141R) doprowadziło do powstania enEbCas12a, który wykazał skuteczność i wierność w edycji genów, „co czyni go atrakcyjnym kandydatem do zastosowań terapeutycznych” – zauważają autorzy. enEbCas12a miał również wyższą wydajność edycji niż EbCas12a typu dzikiego.

Następnie zespół użył AAV-enEbCas12a do namierzenia PCSK9 genu u myszy, który wcześniej uznano za cel terapeutyczny obniżający poziom cholesterolu we krwi.

Trzydzieści dni po wstrzyknięciu poziom cholesterolu w surowicy u sześciu myszy otrzymujących AAV-enEbCas12a znacząco spadł, podczas gdy u sześciu innych myszy otrzymujących sól fizjologiczną buforowaną fosforanami pozostał na normalnym poziomie.

Dane potwierdzają, że enEbCas12a można wykorzystać jako skuteczny system do edycji genomu in vivo poprzez pojedyncze dostarczenie AAV, stwierdził Wang i współpracownicy.

Ze względu na niewielkie efekty niepożądane Cas12a jest bardzo obiecujący pod względem przyszłych zastosowań w leczeniu chorób” – zauważyli.

Na podstawie swoich ustaleń zespół stwierdził, że „enEbCas12a zapewnia obiecujące narzędzie do edycji genomu i potężną platformę dla terapii genowej AAV”.