Ochrona zasobów genetycznych zagrożonych gatunków wodnych nabrała w ostatnich latach coraz większego znaczenia. W wyniku postępu w nauce kriokonserwacji zamrażanie plemników wielu gatunków wodnych stało się dość łatwe, ale dojrzałe komórki jajowe i rozwijające się zarodki to zupełnie inna historia, przynajmniej w przypadku ryb.

Ich stosunkowo duży rozmiar, wysoka zawartość żółtka i ograniczona przepuszczalność błony zwykle sprawiają, że są trudne lub niemożliwe do krioprezerwacji, ale w ostatnich latach wykazano wykonalne obejście problemu. Tkanki i/lub komórki, które ostatecznie rozwijają się w jaja ryb, można krioprezerwować, a następnie rozmrażać i przeszczepiać do sterylnych ryb biorców. Ci zastępczy biorcy mogą być z tego samego gatunku, spokrewnionych gatunków lub w niektórych przypadkach zupełnie niespokrewnionych. Gdy wszystko działa, ryby biorcy rozwijają funkcjonalne gamety męskie lub żeńskie z materiałem genetycznym od pierwotnego dawcy. W rezultacie podejście to oferuje wyraźne korzyści w zakresie ochrony gatunków zagrożonych lub na skraju wyginięcia.

Nauka (uproszczona)

Te nowe granice w ochronie środowiska wodnego koncentrują się na wykorzystaniu komórek rozrodczych i komórek macierzystych gonad, przy czym te ostatnie wyłaniają się jako materiał z wyboru podczas pracy z rybami. Nie wdając się w nadmierne szczegóły, komórki macierzyste są zasadniczo niezróżnicowanymi komórkami, które mogą rozmnażać się w wiele innych komórek tego samego typu, pozostawać uśpione lub różnicować się, aby przejąć określone funkcje. Różne tkanki i narządy, w tym tkanki gonad u ryb, zazwyczaj zawierają pewne komórki macierzyste, które mogą rozwinąć się w nowe, zróżnicowane komórki. Aby krótko podsumować pochodzenie tych tkanek gonad, bardzo wcześnie w rozwoju zarodków ryb można wyróżnić dwa podstawowe typy komórek: komórki rozrodcze i komórki somatyczne. Gdy komórki somatyczne zaczynają tworzyć całość organizmu, komórki rozrodcze trafiają do tkanek, które staną się jajnikami lub jądrami i zaczną się proliferować.

Jeśli komórki macierzyste gonad (lub odpowiednie tkanki spermatogoniów lub oogoniów) od ryb dawców mogą zostać zamrożone i pomyślnie odzyskane, można je wprowadzić do osobników zastępczych, gdzie będą funkcjonować tak jak komórki rozrodcze, migrując do odpowiedniej lokalizacji wewnętrznej i rozwijając się w funkcjonalne gonady (Yoshizaki i Lee 2018). Ryby biorcy są wcześniej sterylizowane, albo poprzez indukcję triploidii, albo poprzez supresję natywnych komórek gonad. A w wielu przypadkach biorcy mogą pochodzić z wyraźnie różnych gatunków. Kiedy biorcy są innego gatunku niż dawca, nawet jeśli są blisko spokrewnieni, są określani jako „ksenogeny”. Wiele ostatnich wyników badań potwierdza, że ​​podejście to stanowi potężne nowe narzędzie do konserwacji zasobów genetycznych u wielu gatunków ryb.

Czy to naprawdę działa?

W 2010 roku Lacerda i in. donieśli o próbach przeprowadzenia transplantacji komórek macierzystych spermatogoniów u tilapi. Przeszczepili świeże lub kriokonserwowane komórki macierzyste z jednego szczepu tilapi do wcześniej wysterylizowanych samców innego szczepu. Kriokonserwowane komórki macierzyste rozwinęły się w plemniki u ryb biorców, ze wskaźnikiem kolonizacji wynoszącym 88 procent. Samce biorców ostatecznie wyprodukowały żywe plemniki i spłodziły potomstwo o genotypie szczepu dawcy.

W tym samym roku Yoshizaki i in. wykazano, że po przeszczepieniu do świeżo wyklutego narybku komórki jajowe pstrąga tęczowego ostatecznie różnicowały się w jaja u samic i plemniki u samców. Podobne wyniki odnotowano u innych ryb, a ta plastyczność oparta na biorcy może również zapewnić alternatywne podejście do hodowli monoseksualnej u wielu gatunków.

W 2012 roku Lee i in. byli w stanie przeszczepić wcześniej zamrożone spermatagonia do triploidalnych pstrągów tęczowych. Prawie połowa tych ryb wyprodukowała funkcjonalne jaja lub plemniki, w zależności od ich płci fenotypowej, co w połączeniu skutkowało normalnym potomstwem. Podobnie, w 2016 roku Lee i Yoshizaki zademonstrowali kriokonserwację, rozmrażanie i przeszczepianie komórek jąder zagrożonego pstrąga mandżurskiego do triploidalnych młodych biorców tego samego gatunku. Przeszczepione spermatogonia migrowały i były włączane do tkanki gonad triploidów, przy czym niektórzy biorcy rozwijali dojrzewające jądra, podczas gdy inni produkowali dojrzewające jajniki. Należy zachować ostrożność, w rzeczywistych warunkach takie podejście wymagałoby wielu dawców komórek macierzystych w celu zminimalizowania wpływu chowu wsobnego, przy czym ksenogeny od jednego dawcy byłyby rozmnażane razem z ksenogenami od innych dawców.

Idziemy o krok dalej z inną zagrożoną rybą, Psenicką i in. (2016) wykorzystali wczesną fazę tkanki jąder i jajników oraz komórki jesiotra syberyjskiego do oceny różnych protokołów obsługi i zamrażania. Zarówno cała tkanka, jak i rozdzielone komórki wykazywały dobrą przeżywalność po rozmrożeniu. Po przeszczepieniu do larw sterleta, po 90 dniach rozmnożyły się u ponad połowy biorców. I dalej przesuwając granice filogenetycznej odległości między dawcami i biorcami, Silva i in. (2016) z powodzeniem przeszczepiono komórki macierzyste spermatogoniów z suma Jundia (Rhamdia królewska) do samca tilapi nilowej. Samce tilapi zostały wysterylizowane przed przeszczepem za pomocą wysokich temperatur i zastrzyków bisulfanu. Do 120. dnia po zabiegu wszystkie ryby biorcy zaczęły produkować plemniki.

Karp pospolity jest jednym z najczęściej hodowanych gatunków w wodach śródlądowych i przez setki lat opracowano wiele odrębnych szczepów. Pojawiły się obawy, że niektóre z tych „dziedzicznych” odmian mogą zostać utracone, jeśli nie zostaną zachowane. Pracując z komórkami oogonialnymi, Franek i in. (2019) dostarczyli dogłębnego przeglądu procedur kriokonserwacji w celu zachowania zasobów genetycznych u tego gatunku. Co ciekawe, niedojrzałe dawczyni wykazujące wczesne stadia rozwoju jajników zapewniły najlepsze wyniki kriokonserwacji, prawdopodobnie ze względu na to, że ich komórki nadal miały odpowiedni poziom przepuszczalności błony. Yaraş i Çek-Yalniz (2021) również zgłosili wyższy sukces przy izolowaniu komórek macierzystych oogonium od młodych pstrągów potokowych o długości około 15 cm.

Niedawno Ye i in. (2020) opracowali procedurę kriokonserwacji komórek macierzystych gonad amerykańskiego wiosłonosa i jesiotra Jangcy. Po roku przechowywania w kriokonserwacji komórki te rozmrożono i przeszczepiono do larw jesiotra, gdzie zostały pomyślnie włączone. Te odkrycia, wraz z odkryciami Psenicka i in. (2016) są szczególnie zachęcające, jeśli weźmiemy pod uwagę, że Międzynarodowa Unia Ochrony Przyrody uznaje około 80 procent gatunków jesiotrów i wiosłonosów za zagrożone lub krytycznie zagrożone.

Witryfikacja igłowa

Istnieją tysiące odrębnych linii danio pręgowanego w badaniach biomedycznych, a co miesiąc powstają nowe. Mając na celu bardziej efektywną konserwację plazmy zarodkowej danio pręgowanego, Marinović i in. (2018) przedstawili wykonalną metodę kriokonserwacji wczesnych stadiów komórek rozrodczych danio pręgowanego przy użyciu spermatogonii i witryfikacji igłowej (NIV). W badaniu uzupełniającym grupa przedstawiła więcej wyników NIV z wysokim wskaźnikiem powodzenia. NIV oferuje pewne wyraźne zalety podczas kriokonserwacji małych próbek tkanek. Wymagania dotyczące krioochronnych środków są zmniejszone, ponieważ próbki tkanek są przypinane do igły akupunkturowej, umieszczane w środowisku krioochronnym, a następnie usuwane i umieszczane w roztworze witryfikacji, a następnie zanurzane bezpośrednio w ciekłym azocie.

Kilku tych samych badaczy z Marinović i in. badania wymienione powyżej już w 2017 r. informowały o optymalizacji protokołów NIV dla tkanki jajnika łososiowatych, w szczególności tkanki jajnika młodych pstrągów potokowych. A w 2022 r. część tej samej grupy badawczej informowała o stosowaniu NIV z wykorzystaniem tkanki jajnika u jesiotrów Acipenser ruthenus I A. gueldenstaedtiiRozmrożone komórki skutecznie skolonizowały gonady ryb-biorców, a wyniki potwierdziły, że NIV jest dodatkowym narzędziem w ochronie zagrożonych gatunków jesiotra.

Produkcja akwakultury

Oprócz inicjatyw konserwacyjnych, wykorzystanie zastępczego stada hodowlanego oferuje szereg potencjalnych korzyści dla poprawy genetycznej w akwakulturze. Ryby o lepszych lub unikalnych cechach mogą dostarczać komórki do transplantacji do wielu biorców, znacznie zwiększając produkcję wybranego potomstwa. Możliwe jest również wykorzystanie gatunków biorców o stosunkowo krótkich odstępach między pokoleniami w celu przyspieszenia programów selekcji dla gatunków dawców, które wymagają dłuższego czasu, aby osiągnąć dojrzałość. A gdy pożądane są hybrydowe stada produkcyjne, technologie ksenogeniczne mogą oferować praktyczną alternatywę dla sztucznego tarła na dużą skalę.

W USA hodowla sumów stała się w dużym stopniu zależna od hodowli hybrydowych uzyskanych przy użyciu sumika błękitnego (Ictalurus furcatus) samce i sumiki kanałowe (I. punctatus) samice. Te hybrydy oferują lepsze cechy pod względem wzrostu, konwersji paszy i odporności na choroby. Niestety, muszą być sztucznie produkowane w wylęgarniach z powodu niezgodności behawioralnych, które skutkują ograniczonym i w dużej mierze zawodnym tarłem wolicjonalnym między gatunkami rodzicielskimi. A ponieważ samce suma błękitnego nie mogą być rozmnażane pasowo, muszą być poświęcane w tym procesie, co znacznie zwiększa roczne zapotrzebowanie na samce stada zarodowego. Naukowcy z Uniwersytetu w Auburn rozpoczęli ocenę wykorzystania metod ksenogenicznych w celu rozwiązania tej sytuacji kilka lat temu, a ich postępy są imponujące.

Perera i in. (2017) opublikowali pierwszy raport o ksenogenicznej produkcji hybryd kanałowych x niebieskich, choć z bardzo ograniczonymi wynikami. Przeszczepili spermatogonia niebieskiego suma do triploidalnego samca suma kanałowego, a dwa lata później zebrali plemniki od jednego z tych ksenogenów i z powodzeniem użyli ich do zapłodnienia jaj suma kanałowego, co zaowocowało potomstwem hybrydowym. Niedługo potem Shang i in. doniesiono o izolacji i udanej transplantacji komórek rozrodczych jąder sumika błękitnego do blastuli sumika kanałowego. Teoretycznie powstałe ksenogeniczne samce sumika kanałowego mogłyby się naturalnie rozmnażać z samicami sumika kanałowego każdego roku po osiągnięciu dojrzałości, produkując hybrydowe potomstwo w ilościach komercyjnych.

Do 2020 r. Abualreesh i in. opracowano i opublikowano niezawodny protokół dotyczący mrożenia spermatogoniów sumika błękitnego, z dodatkowymi udoskonaleniami

w 2021 r. Zdając sobie sprawę, że posiadanie zamrożonych komórek macierzystych w repozytoriach miałoby realny potencjał do przyspieszenia produkcji hybrydowych sumów na skalę komercyjną, naukowcy z Auburn naciskali dalej i do 2022 r. Hettiarachchi i in. zaprezentowano produkcję ksenogenów sumika kanałowego przy użyciu kriokonserwowanych tkanek jąder i jajników sumika błękitnego.

Badania te są kontynuowane w Auburn, a metody i protokoły są stale udoskonalane, ale mogą pojawić się również nowe zastosowania. Zazwyczaj ikry rybiej nie uważa się za szczególnie cenny towar, z wyjątkiem kawioru. Zwłaszcza kawioru z jesiotra. W 2023 roku Jacob Al-Armanazi ukończył pracę magisterską w Auburn. Jednym z celów jego badań było przeszczepianie komórek macierzystych oogonium i spermatogonia z jesiotra jeziornego do triploidalnego suma hybrydowego (suma białego x suma niebieskiego) oraz z jesiotra syberyjskiego do triploidalnego suma kanałowego. Prawie 89 procent biorców sumów hybrydowych wykazywało proliferację komórek macierzystych jesiotra jeziornego i chociaż wyniki nie były tak imponujące w przypadku przeszczepionych sumów kanałowych, komórki macierzyste jesiotra syberyjskiego przetrwały u prawie 77 procent biorców.

Podsumowując, w miarę jak nasze zrozumienie i opanowanie produkcji ksenogenicznej u ryb postępuje, może to przynieść szereg korzyści. Ochrona i zachowanie plazmy zarodkowej będzie nadal stanowić istotną kwestię na całym świecie, dla wszystkich osób pracujących z zagrożonymi i ginącymi gatunkami ryb, a także dla szeregu sektorów w ramach komercyjnej akwakultury. W nadchodzących latach kriokonserwacja i późniejsza transplantacja komórek macierzystych gonad nabiorą coraz większego znaczenia u szeregu gatunków ryb.