Warianty genetyczne, takie jak mutacje, rekombinacje lub transpozycje, występują naturalnie w hodowanych mikroorganizmach i często są uważane za mutacje nieneutralne.

Mutacje neutralne nie są ani korzystne, ani szkodliwe dla organizmu i dotyczą tylko niewielkiej części całej populacji. Z drugiej strony mutacje nieneutralne mogą wpływać na większą część populacji, potencjalnie zmieniając pulę genów, w zależności od zalet lub wad zapewnianych przez wariant genetyczny. Mutacje te można określić ilościowo genotypowo przy użyciu różnych metod sekwencjonowania.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR) jest uważana za skuteczną metodę sekwencjonowania do pomiaru poszczególnych wariantów genetycznych. Jednak może to być kosztowne i czasochłonne. W przeciwieństwie do tego, sekwencjonowanie Sangera jest szybkie i opłacalne, ale jego dokładność nie wystarcza do ilościowego określenia mutacji w mieszaninach plazmidów pochodzących z heterogenicznej populacji.

Ponieważ mutacje neutralne mogą stać się dominujące z powodu zmieniających się warunków środowiskowych, co skutkuje selekcją przejściową lub kontrselekcją, ważne jest dokładne oszacowanie proporcji zmutowanych i dzikich sekwencji DNA. Co więcej, taka ocena ilościowa DNA mogłaby usprawnić wczesne diagnozowanie chorób i skuteczne opracowywanie leków. W związku z tym zespół naukowców z Europy opracował nowatorską metodę — qSanger — do ilościowego określania wariantów genetycznych i identyfikowania mutacji neutralnych/nieneutralnych.

„Metodologia qSanger zaproponowana w naszym badaniu wykorzystuje dane z sekwencjonowania Sangera do pomiaru stosunku zmienności genetycznej w kulturze bakteryjnej” – mówi prof. badanie.

Badanie zostało opublikowane w Badania bioprojektowe.

Najpierw zespół wykorzystał 10 najlepszych kompetentnych komórek Escherichia coli (E. coli), które hodowano w warunkach tlenowych w obecności antybiotyków. Kolonie bakteryjne kotransformowano dwoma plazmidami — P1 i P2. Następnie wykorzystali sekwencjonowanie Sangera do wygenerowania elektroforogramu z wieloma śladami dla kolonii bakteryjnych kotransformowanych z P1 i P2. Dwa plazmidy również sekwencjonowano indywidualnie.

Następnie ślady z sekwencji P1 i P2 dopasowano do zmieszanych śladów P1:P2. Na koniec zastosowali metodę qSanger do ilościowego określenia plazmidowego DNA, wykorzystując stosunki amplitud wyrównanych pików elektroforogramu z mieszanych odczytów sekwencjonowania Sangera.

Aby łatwo zmierzyć proporcje plazmidów, zespół użył różnych markerów fluorescencyjnych z dwoma konstruktami plazmidowymi – mCherry (czerwony) w plazmidzie P1 i wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (EGFP) w plazmidzie P2. Te plazmidy wykazujące ekspresję fluorescencji pomogły również w walidacji metody qSanger zarówno in vitro, jak iw kotransformowanych bakteriach przy użyciu standardowych metod oznaczania ilościowego DNA.

Najpierw zweryfikowali metodę qSanger, mierząc stosunek plazmidowego DNA w różnych mieszaninach komórek tylko P1 i P2. Następnie zespół ocenił stosunki P1:P2 w ​​kotransformowanych komórkach E. coli za pomocą qPCR i oznaczeń fluorescencyjnych. W obu przypadkach stosunek P1:P2 obliczony metodą qSanger korelował z innymi stosunkami plazmidowego DNA.

Wyniki te pokazują dokładność metodologii qSanger w ilościowym określaniu wariantów genetycznych w komórkach z mieszanych sekwencji Sangera, udowadniając, że jej skuteczność jest porównywalna z innymi podejściami do ilościowego oznaczania DNA. Jednak to, co wyróżnia tę metodologię na tle technologii takich jak qPCR i cyfrowy PCR kropelkowy, to łatwość użycia oraz znacznie obniżone koszty i pracochłonność.

Omawiając potencjalne zastosowania tego nowatorskiego podejścia, prof. inżynieria genomu. Co więcej, może być stosowany w zastosowaniach wymagających ilościowego oznaczania wielu sekwencji DNA lub RNA w tej samej mieszaninie”.

Biorąc pod uwagę rosnące zastosowania sekwencjonowania DNA w różnych dziedzinach, metodologia qSanger może po prostu przesunąć granicę dokładnych, oszczędzających czas i opłacalnych ocen DNA.