LOS ANGELES — To, że zaszczyt otwarcia konferencji Prezydenckiego Sympozjum Amerykańskiego Towarzystwa Terapii Genowej i Komórkowej (ASGCT) przypadło laureatce Nagrody Nobla w 2020 r., dr Jennifer Doudna, pionierce edycji genomu CRISPR, nie było zaskoczeniem. Ale temat prezentacji Doudny – nowe badania na arenie terapii limfocytami T – mógł unieść kilka brwi w wypełnionej po brzegi publiczności.

Doudna jest profesorem nauk biomedycznych Li Ka Shing Chancellor na Uniwersytecie Kalifornijskim w Berkeley, współzałożycielem Innovative Genomics Institute (IGI) i badaczem w Howard Hughes Medical Institute. Jest współzałożycielką kilku firm zajmujących się edycją genomu, w tym Caribou Biosciences, Intellia Therapeutics i Mammoth Biosciences.

Ponad dekadę po przełomowym CRISPR-Cas9 z 2012 roku Nauka W artykule, którego współautorem jest dr Emmanuelle Charpentier i współpracownicy, Doudna podkreślił translacyjne aspekty edycji genu CRISPR-Cas9 w wykładzie zatytułowanym „CRISPR Chemistry and Applications in the Clinic”.

„Jednym z powodów, dla których założyłem Instytut Innowacyjnej Genomiki [in 2014] ponieważ CRISPR jako technologia ma niesamowity potencjał wpływania na życie ludzi, jeśli uda nam się wymyślić, jak sprawić, by te narzędzia były szerzej dostępne w klinice” – stwierdził Doudna w nagranym wcześniej filmie.

Rozpoznawanie DNA pod kontrolą RNA rozwinęło się jako potężny zestaw narzędzi z możliwościami, takimi jak rozbijanie genów, naprawa genów, kontrola transkrypcji, diagnostyka i obrazowanie. Jednak Doudna opisał dwa kluczowe obszary, które nadal stanowią wyzwanie dla potencjału klinicznego CRISPR: skuteczne dostarczanie edytora genomu i zapewnienie precyzji edycji.

Z utratą chromosomu

Doudna skupiła się na zastosowaniach edycji CRISPR w terapiach adoptywnych komórkami T. Zacytowała przełomowe badanie Carla June, MD i współpracowników z University of Pennsylvania z 2020 r., w którym opisano badanie kliniczne fazy I w celu oceny bezpieczeństwa i wykonalności edycji genu CRISPR-Cas9 u trzech pacjentów z zaawansowanym rakiem. W badaniu tym oceniano edycję genów CRISPR ex vivo, w której limfocyty T usunięto z organizmu pacjenta, zredagowano przy użyciu CRISPR w celu przerwania kluczowych genów odporności przeciwnowotworowej i ponownie wprowadzono do organizmu pacjenta.

Doudna opisał wyzwania związane z precyzyjną edycją, ponieważ przerwy wprowadzone do genomu z edycji CRISPR-Cas9 mogą wywołać nieprawidłowe efekty, takie jak utrata chromosomów. Kluczowe pytania obejmują zrozumienie, jak powszechne jest to zjawisko i jakie czynniki na nie wpływają. Ponadto, czy utrata chromosomów wpływa na żywotność kliniczną i czy można jej uniknąć?

W badaniu opublikowanym jako preprint bioRxiv, prowadzonym przez absolwenta laboratorium Doudna, Connora Tsuchidę, występowanie utraty chromosomów oceniano przy użyciu 400 pojedynczych przewodników RNA, które obejmowały aktywne i nieaktywne geny i były ukierunkowane na każdy chromosom. Wyniki wskazują, że ponad 3% docelowych pierwotnych ludzkich komórek T miało całkowitą lub częściową utratę chromosomów w wyniku rozszczepienia Cas9, co wskazuje, że utrata chromosomów występuje niezależnie od prowadzącego RNA lub wyboru celu.

Ale co te obserwacje oznaczały dla żywotności klinicznej?

Tsuchida znalazła odpowiedzi po nieoczekiwanym połączeniu się z Howardem Changiem, doktorem medycyny, profesorem badań nad rakiem i genetyki na Uniwersytecie Stanforda, na konferencji w Cold Spring Harbor Laboratory w zeszłym roku. Chang miał dodatkowe dane od pacjentów, którym podano infuzję komórek T, które nie zostały jeszcze opublikowane. I tak zaczęła się współpraca.

„Co było bardzo interesujące, to to [analysis of these T cells from clinical trials] wskazywało na bardzo małą utratę chromosomów u tych pacjentów. To była zaskakująca obserwacja!” — wykrzyknęła Doudna. „Kiedy wzięliśmy komórki, które miały te same modyfikacje wykonane w laboratorium, zobaczyliśmy, że one zrobił spowodować utratę chromosomów. Więc co się dzieje?

Doudna przedstawił przekonujące dane, które wskazywały, że różnica została wyjaśniona kolejnością operacji między protokołami laboratoryjnymi i próbami klinicznymi. W laboratorium pierwotne limfocyty T są izolowane, aktywowane i stymulowane przed traktowaniem odczynnikami, takimi jak CRISPR-Cas9. Alternatywnie protokół kliniczny aktywuje i stymuluje komórki Po leczenie odczynnikami CRISPR-Cas9.

Przyczyna tej różnicy w protokole była całkowicie praktyczna. W warunkach klinicznych nie było wystarczającej ilości Cas9 produkowanego przez GMP, aby można go było użyć na komórkach, które zostały najpierw aktywowane i stymulowane.

„Stwierdziliśmy, że [method in which] manipulowanie tymi komórkami może zminimalizować utratę chromosomów przy jednoczesnym zachowaniu wydajności edycji, co może być bardzo ważną zmianą w przyszłości [implementation of these therapies]– zauważył Doudna.