Naukowcy z Kyushu University i Nagoya University School of Medicine opracowali zoptymalizowaną metodę edycji genomu, która znacznie zmniejsza niepożądane mutacje i toksyczność w CRISPR-Cas9. Nowa technika, zwana „bezpiecznym gRNA” (ang.[C]gRNA), wykazuje potencjał bezpiecznej i skutecznej terapii genowej, z zastosowaniami w leczeniu chorób genetycznych, takich jak fibrodysplasia ossificans progressiva.

CRISPR-Cas9 to powszechna technika edycji genomu wykorzystywana do badania określonych genów i modyfikowania genów związanych z chorobami. Ma jednak wady, takie jak niezamierzone mutacje i toksyczność, co wymaga opracowania technologii, która minimalizuje te skutki uboczne, aby zwiększyć jej przydatność w przemyśle i medycynie.

Naukowcy z Kyushu University w południowej Japonii i Nagoya University School of Medicine w środkowej Japonii stworzyli udoskonalone podejście do edycji genomu, które znacząco redukuje mutacje, torując drogę do skuteczniejszego leczenia zaburzeń genetycznych z redukcją niepożądanych mutacji. Ich badania zostały opublikowane w Inżynieria Biomedyczna Przyrody.

Technologia edycji genomu skoncentrowana na CRISPR-Cas9 zrewolucjonizowała przemysł spożywczy i medyczny. W technologii nukleaza Cas9, enzym tnący[{” attribute=””>DNA, is introduced into the cell with a synthetic guide RNA (gRNA) that guides the enzyme to the required location. By cutting the genome, unwanted genes can be deleted, and new (functional) genes can be added in easily and quickly.

One of the drawbacks of genome editing is that there are growing concerns about mutations and off-target effects. This is often caused by the enzyme targeting genomic sites that have a sequence similar to the target site. Similarly, mutations at the chromosome level can occur when genes are altered, which has hindered clinical trials of gene therapy for cancer and even resulted in the deaths of patients undergoing treatment for muscular dystrophy. The group hypothesized that current editing protocols that use Cas9 cause excessive DNA cleavage, resulting in some of the mutations.

To test this hypothesis, a group consisting of Assistant Professor Masaki Kawamata at Kyushu University and Professor Hiroshi Suzuki at the Nagoya University Graduate School of Medicine constructed a system called “AIMS” in mouse cells, which evaluated the activity of Cas9 separately for each chromosome. Their results showed that the commonly used method was associated with very high editing activity. They determined that this high activity was causing some of the unwanted side effects, so they searched for gRNA modification methods that could suppress it. They found that an extra cytosine extension to the 5′ end of the gRNA was effective as a “safeguard” for the overactivity and allowed control over DNA cleavage. They called this fine-tuning system ‘safeguard gRNA’ ([C]gRNA).”

Ich wyniki były uderzające. Dzięki nowej technice udało się zredukować efekty pozacelowe i cytotoksyczność, zwiększyć wydajność selektywnej edycji pojedynczego allelu oraz zwiększyć skuteczność naprawy ukierunkowanej na homologię, najczęściej stosowanego mechanizmu naprawy pęknięć podwójnej nici DNA.

Aby przetestować jego skuteczność w środowisku medycznym, zbadali rzadką chorobę zwaną fibrodysplasia ossificans progressiva. Korzystając z modelu mysiego, byli w stanie stworzyć ten sam genotyp, co ludzka wersja choroby. Następnie, używając komórek iPS pochodzących od pacjentów, byli w stanie precyzyjnie naprawić uszkodzenia do pojedynczego nukleotydu, szczególnie w związanym z chorobą allelu powodującym chorobę, demonstrując przydatność swojej techniki jako bezpiecznej i skutecznej metody terapii genowej.

Zespół skonstruował również pierwszy model matematyczny korelacji między różnymi wzorcami edycji genomu a aktywnością Cas9, który umożliwiłby użytkownikowi symulowanie wyników edycji genomu w całej populacji komórek. Ten przełom pozwoliłby naukowcom określić aktywność Cas9, która maksymalizuje wydajność, redukując ogromne koszty i wymaganą pracę.

„Stworzyliśmy nową platformę do edycji genomu, która może zmaksymalizować pożądaną wydajność edycji poprzez opracowanie regulacji aktywności [C]gRNA z odpowiednią aktywnością Cas9. Co więcej, odkryliśmy, że „zabezpieczenie gRNA” można zastosować w różnych narzędziach CRISPR, które wymagają gRNA poprzez regulację ich aktywności, takich jak te wykorzystujące Cas12a, który ma inny mechanizm rozszczepiania DNA” – powiedział profesor Suzuki. „W przypadku technik wykorzystujących Cas9 do aktywacji lub tłumienia interesujących genów, takich jak aktywacja CRISPR i interferencja CRISPR, nadmierna indukcja lub supresja ekspresji genów może być nieużyteczna, a nawet szkodliwa dla komórek. Kontrolowanie poziomów ekspresji przez [C]gRNA to ważna technologia, którą można wykorzystać do różnych zastosowań, w tym do wdrożenia precyzyjnej terapii genowej”.

Grupa pracuje obecnie nad biznesplanem start-upu, aby rozpowszechnić nową platformę do edycji genomu. „W szczególności wierzymy, że ta technologia może wnieść znaczący wkład w dziedzinę medycyny” — powiedział dr Kawamata. „Obecnie oceniamy jego skuteczność terapeutyczną i bezpieczeństwo dla wybranych chorób docelowych w eksperymentach na komórkach i zwierzętach oraz wykorzystujemy go do pomocy w opracowywaniu leków terapeutycznych i metod terapii genowej, zwłaszcza w przypadku rzadkich chorób, dla których nie ustalono jeszcze metod leczenia”.

Odniesienie: „Optymalizacja aktywności Cas9 poprzez dodanie rozszerzeń cytozyny do pojedynczych przewodników RNA” Masaki Kawamata, Hiroshi I. Suzuki, Ryota Kimura i Atsushi Suzuki, 10 kwietnia 2023 r., Inżynieria Biomedyczna Przyrody.
DOI: 10.1038/s41551-023-01011-7