W niedawnym badaniu opublikowanym w Biologia genomu, badacze badają wpływ nowej mutacji powodującej utratę funkcji w genie odporności na utlenianie 1 (OXR1) na funkcje komórkowe, rozwój układu nerwowego i mechanizmy molekularne w ludzkim mózgu.

Badanie: Mutacja powodująca utratę funkcji w ludzkiej odporności na utlenianie 1 zakłóca przestrzenno-czasową regulację metylacji histonów argininy w rozwoju neurologicznym. Źródło zdjęcia: Kittyfly / Shutterstock.com

Tło

OXR1 jest konserwatywnym genem kluczowym dla odporności na stres oksydacyjny, odgrywając tym samym istotną rolę w różnych procesach komórkowych i chorobach. Chociaż OXR1 nie jest bezpośrednim źródłem uszkodzeń DNA, pośrednio wpływa na systemy odpowiedzi na uszkodzenia DNA, procesy antyoksydacyjne i ochronę neuronów.

Pomimo ustalonej roli OXR1 w szerokim zakresie procesów biologicznych i jego związku z różnymi chorobami, szczegółowe mechanizmy molekularne, zwłaszcza strukturalne i funkcjonalne role jego specyficznych domen w ludzkich stanach neurologicznych, pozostają w dużej mierze niezbadane i słabo poznane.

O badaniu

Obecne badanie dotyczyło in vitro badania z wykorzystaniem unieśmiertelnionych linii komórkowych limfoblastów uzyskanych od pacjenta będącego człowiekiem, linii kontrolnej zakażonej wirusem Epsteina-Barra, komórek fibroblastów i komórek kostniakomięsaka U2OS.

Żywotność komórek i apoptozę badano za pomocą testów z udziałem nadtlenku wodoru (H₂O₂) ekspozycja, cytometria przepływowa i barwienie terminalną deoksynukleotydylotransferazą dUTP nick end labeling (TUNEL). Naukowcy zmierzyli także reaktywne formy tlenu (ROS) i przeprowadzili wysokosprawną chromatografię cieczową połączoną z analizą tandemowej spektrometrii mas (HPLC–MS/MS) 8-oksodihydrochiny (dG) w genomowym DNA w celu oceny stresu oksydacyjnego.

Z fibroblastów pacjentów wygenerowano ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), które różnicowały się w komórki nerwowe. Formułowanie organoidów mózgowych i organoidów mózgowych specyficznych dla regionu umożliwiło badanie wpływu mutacji OXR1 na rozwój mózgu. Potwierdzono to za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, analizy znakowania immunologicznego, sekwencjonowania kwasu rybonukleinowego (RNA) i testów ligacji zbliżeniowej, które skupiały się na interakcji między OXR1 i innymi białkami.

Wyniki badań

W niniejszym badaniu badającym konsekwencje niedoboru OXR1 trzy siostry urodzone przez kuzynów pierwszego stopnia wykazywały opóźnienia rozwojowe, hipoaktywność, problemy poznawcze i epilepsję od najmłodszych lat. Podczas badań klinicznych zgłaszano uogólnioną hipotonię, hiporefleksję, ataksję i brak komunikacji. Co więcej, elektroencefalogramy wykazały silną aktywność padaczkową, podczas gdy rezonans magnetyczny (MRI) ujawnił zwyrodnienie móżdżku i ciała modzelowatego.

W szerszych bazach danych DNA populacji nie było homozygotycznego wariantu znalezionego podczas sekwencjonowania egzomu w obrębie genu OXR1. Mutacja wykluczyła ekson 18 z OXR1, który jest wymagany do utrzymania stabilności białka, zwłaszcza jego końca C zawierającego domenę związaną z TBC/LysM (TLDc).

Aby zrozumieć funkcjonalne konsekwencje niedoboru OXR1, zbadano linie komórkowe limfoblastów (LB) od pacjenta i zdrowego rodzeństwa. Komórki pacjenta wykazywały zmniejszoną proliferację, zwiększoną wrażliwość na stres oksydacyjny i zwiększoną apoptozę.

Podwyższony poziom 8-oksoguaniny w DNA pacjenta wskazywał na zwiększone uszkodzenia oksydacyjne DNA. Co więcej, komórki te wykazywały zwiększoną częstotliwość mutacji mitochondrialnego DNA i zmienioną ekspresję genów odpowiedzi na stres, co podkreśla rolę OXR1 we wzroście komórkowym, przeżyciu i odpowiedzi na stres oksydacyjny.

Naukowcy wygenerowali także iPSC z fibroblastów pacjentów. Te iPSC, którym brakowało OXR1, wykazywały znaczne deficyty w różnicowaniu neuronów, z nieregularną morfologią agregatów nerwowych, zmniejszonym wzrostem neurytów i zmniejszoną ekspresją markerów neuronalnych.

Analiza transkryptomu podczas różnicowania neuronów ujawniła, że ​​OXR1 wpływa na ekspresję genów, ze znaczącym wpływem na geny związane z zanikiem móżdżku, zaburzeniami ze spektrum autyzmu i schizofrenią. Analizy szlaków wykazały zakłócenie szlaków rozwoju neuronów w komórkach z niedoborem OXR1.

Stwierdzono także, że OXR1 wchodzi w interakcję z białkowymi metylotransferazami argininowymi (PRMT), które są kluczowymi regulatorami ekspresji genów. Niedobór OXR1 spowodował upośledzoną metylację histonów argininy i lizyny, które są kluczowe dla neurogenezy. Wyniki badania wykazały również, że domena TLDc OXR1 jest niezbędna do stymulacji metylacji histonów katalizowanej PRMT5, co podkreśla jej rolę w regulacji transkrypcji podczas neurogenezy.

Aby naśladować niedobór OXR1 w bardziej złożonym modelu, opracowano organoidy ludzkiego mózgu pochodzące z iPSC pacjentów. Organoidy te wykazywały nieprawidłowości strukturalne i rozwojowe, w tym opóźnione nawarstwianie się neuronów i zmniejszone tworzenie określonych obszarów mózgu. Stwierdzono również, że niedobór OXR1 zakłóca różne modyfikacje histonów, wpływając w ten sposób na wczesny rozwój mózgu, szczególnie w obszarach kory mózgowej i śródmózgowia.