Na początku lat 90. naukowcy badający rozwój glisty zidentyfikowali małą cząsteczkę RNA, która reguluje ekspresję określonych genów. Oznaczało to odkrycie mikroRNA (miRNA), o których obecnie wiadomo, że są obecne we wszystkich formach życia. Jak się okazuje, cząsteczki te odgrywają istotną rolę w wielu procesach biologicznych.

Kilka lat później naukowcy zdali sobie sprawę, że choroby mogą zaburzać ekspresję miRNA, podkreślając ich potencjał jako biomarkerów. W rzeczywistości nieprawidłowa ekspresja miRNA jest cechą charakterystyczną wszystkich chorób związanych z nowotworami. Zatem techniki wykrywania miRNA mogą być przydatne do wczesnego wykrywania raka.

Jednak miRNA są małe i łatwo ulegają degradacji, co utrudnia ich szybkie wykrywanie i oznaczanie ilościowe. Aby wykryć miRNA w próbce, zwykle konieczne jest ich najpierw „wzmocnienie”. Mówiąc prościej, oznacza to wielokrotną replikację docelowego miRNA za pomocą procesów biochemicznych, dzięki czemu ten miRNA jest łatwiejszy do wykrycia za pomocą niedrogich metod. Niestety, wykonanie większości najnowocześniejszych technik amplifikacji miRNA może zająć ponad pięć godzin, co ogranicza ich zastosowanie w testach w miejscu opieki.

Na tym tle zespół badawczy, w skład którego wchodzi profesor nadzwyczajny Chong Zhang z Uniwersytetu Tsinghua w Chinach, opracował niedawno nową metodologię szybkiej amplifikacji i wykrywania miRNA. Jak wyjaśniono w ich najnowszym artykule, który został opublikowany 27 marca 2023 r Badania bioprojektowezespół połączył dwie dobrze zbadane techniki biochemiczne w jedną w sposób, który znacznie skrócił całkowity wymagany czas.

Pierwsza technika, której użyli, nazywa się amplifikacją toczącego się koła (RCA). W RCA pomysł polega na zaprojektowaniu kolistej cząsteczki DNA lub „sondy”, z którą wiąże się docelowy fragment RNA. Następnie, po wprowadzeniu enzymów polimerazy DNA i niezbędnych bloków budulcowych DNA, fragment RNA jest wydłużany poprzez dodanie nukleotydów komplementarnych do kolistej sondy. W wyniku tego procesu powstaje długa, pojedyncza nić materiału genetycznego, która zawiera wiele kopii kolistej sondy.

W tym miejscu do gry wchodzi druga technika, CRISPR-Cas12a. CRISPR-Cas12a jest szeroko stosowanym narzędziem genetycznym, w którym kompleks molekularny jest modyfikowany tak, aby wiązał się z określoną sekwencją DNA. W tym przypadku naukowcy zaprojektowali kompleks tak, aby wiązał się z regionem w sekwencji komplementarnej do kolistej sondy. Oznacza to, że kompleksy CRISPR-Cas12a wiązały się wielokrotnie wzdłuż pojedynczej nici DNA, która została wyprodukowana przez RCA. Po związaniu tych kompleksów część Cas12a aktywowała się, oddzielając sondę fluorescencyjną od jej wygaszacza. To z kolei stworzyło łatwo wykrywalny sygnał fluorescencyjny, który był jaśniejszy, im bardziej amplifikowano początkowy docelowy RNA.

Poza połączeniem tych technik, naukowcy poprawili czas reakcji na etapie RCA, stosując „precyrkularyzowane sondy”. Oznacza to, że w przeciwieństwie do większości standardowych procedur RCA, sondy otrzymały okrągły kształt wcześniejszy do reakcji. Jak zauważa prof. Zhang, znacznie przyspieszyło to proces wykrywania bez uszczerbku dla wydajności systemu: „Wykrywanie miRNA można było zakończyć w zaledwie 70 minut, zamiast zwykłych pięciu godzin, z doskonałym limitem wykrywania 8,1 pM i bardzo wysoką specyficznością.„

Ogólnie rzecz biorąc, proponowane podejście rysuje świetlaną przyszłość dla wykrywania miRNA i ich wykorzystania jako biomarkerów. Zadowolony z wyników prof. Zhang podsumowuje: „Nasz projekt poprawia skuteczność strategii wykrywania opartych na CRISPR-Cas i RCA oraz wykazuje ogromny potencjał w wykrywaniu laboratoryjnym i testowaniu w miejscu opieki.„Ponieważ techniki stosowane w tej metodologii nie są zbyt drogie ani skomplikowane w wykonaniu, możliwe jest powszechne przyjęcie proponowanego podejścia w warunkach klinicznych.

Wysiłki te utorują drogę do lepszych narzędzi diagnostycznych przeciwko rakowi i innym chorobom wpływającym na ekspresję miRNA.