Edycja podstawowa, wszechstronna forma edycji genów, która może korygować większość znanych mutacji genetycznych powodujących choroby, ma teraz nowy sposób dostarczania swojej maszynerii do komórek żywych zwierząt.

Zespół naukowców z Broad Institute of MIT i Harvardu opracował cząstki wirusopodobne, które umożliwiają dostarczanie głównych redaktorów do komórek myszy z wystarczająco dużą wydajnością, aby uratować chorobę genetyczną. W nowej pracy opublikowanej w Biotechnologia Przyrodyzespół zaadaptował wcześniej zaprojektowane cząstki wirusopodobne (eVLP), aby przenosić edytory podstawowe — inny rodzaj precyzyjnego edytora genów, który dokonuje jednoliterowych zmian w DNA.

Teraz badacze opisują, w jaki sposób przeprojektowali zarówno eVLP, jak i części maszynerii podstawowej edycji białek i RNA, aby zwiększyć wydajność edycji nawet 170 razy w komórkach ludzkich w porównaniu z poprzednimi eVLP, które dostarczają podstawowe edytory.

Zespół wykorzystał swój nowy system do skorygowania chorobotwórczych mutacji w oczach dwóch mysich modeli ślepoty genetycznej, częściowo przywracając im wzrok. Dostarczyli także do mózgu myszy najlepszych redaktorów i nie wykryli żadnej edycji niezgodnej z celem.

„To badanie stanowi pierwszy przypadek, w którym wiemy, że dostarczanie kompleksów białko-RNA zostało wykorzystane w celu uzyskania terapeutycznej edycji pierwotnej u zwierzęcia” – powiedział David Liu, starszy autor badania oraz profesor Richarda Merkina i dyrektor Instytutu Merkin Technologie transformacyjne w opiece zdrowotnej na szeroką skalę. Liu jest także badaczem z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa i profesorem na Uniwersytecie Harvarda.

Dylemat dostawy

Podejścia polegające na edycji genów obiecują leczyć szereg chorób poprzez precyzyjną korektę mutacji genetycznych powodujących choroby. Montaż główny, opisany w 2019 r. przez grupę Liu, może powodować dłuższe i bardziej zróżnicowane typy zmian DNA niż inne rodzaje montażu. Jednakże dostarczenie złożonej maszynerii do edycji genów do komórek żywych zwierząt było wyzwaniem.

Podstawowy system edycji składa się z trzech elementów: białka Cas9, które może naciąć DNA; opracowany główny przewodnik edycji RNA (pegRNA), który określa lokalizację edycji i zawiera także nową edytowaną sekwencję do zainstalowania w tym miejscu; oraz odwrotną transkryptazę, która wykorzystuje pegRNA jako matrycę do wprowadzania specyficznych zmian w DNA.

Naukowcy wykorzystali różne metody dostarczania tych maszyn molekularnych do komórek, w tym nanocząsteczki lipidowe i wirusy. Szczególne zainteresowanie wzbudziły również cząstki wirusopodobne (VLP), składające się z otoczki białek wirusowych, które przenoszą ładunek, ale pozbawione są wirusowego materiału genetycznego. Jednak VLP tradycyjnie zapewniały skromne wyniki w zakresie dostaw u zwierząt i muszą być specjalnie zaprojektowane dla każdego rodzaju ładunku, aby skutecznie dostarczać je do komórek.

„Początkowo mieliśmy nadzieję, że będziemy mogli po prostu wykorzystać eVLP, które starannie opracowaliśmy i zoptymalizowano pod kątem edycji podstawowej, i zastosować je u głównych redaktorów” – powiedział Meirui An, absolwent w laboratorium Liu i pierwszy autor nowego artykułu. „Ale kiedy tego próbowaliśmy, nie zaobserwowaliśmy prawie żadnego najlepszego montażu”.

Przełomy w wąskich gardłach

W ramach nowej pracy naukowcy gruntownie przeprojektowali zarówno białka eVLP, jak i samą maszynę do edycji głównej, tak aby zarówno systemy dostarczania, jak i edycji działały wydajniej. Na przykład udoskonalili sposób pakowania głównego ładunku do eVLP, sposobu oddzielania go od pojazdu dostawczego i sposobu dostarczania do jąder komórek docelowych.

„Ładunek głównego redaktora musi zostać skutecznie zapakowany do eVLP w momencie formowania się cząstek, ale musi także zostać skutecznie uwolniony z cząstek po wejściu do komórki docelowej” – powiedziała Aditya Raguram, była absolwentka laboratorium Liu i współautorka badania. „Wszystkie te etapy muszą być starannie zaaranżowane, aby osiągnąć efektywną edycję główną za pośrednictwem eVLP”.

Chociaż każde indywidualne ulepszenie prowadziło do małego skoku w wydajności głównych redaktorów, zmiany razem miały znacznie większy wpływ.

„Kiedy połączyliśmy wszystko razem, zaobserwowaliśmy około 100-krotną poprawę w porównaniu z eVLP, od których zaczynaliśmy” – powiedział Liu. „Tego rodzaju poprawa wydajności powinna wystarczyć, aby zapewnić nam terapeutycznie odpowiedni poziom najlepszego montażu, ale nie wiedzieliśmy tego na pewno, dopóki nie przetestowaliśmy tego na zwierzętach”.

Testy in vivo

Liu i jego współpracownicy, we współpracy z Krzysztofem Palczewskim z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine, najpierw przetestowali system na myszach, aby skorygować dwie różne mutacje genetyczne w oczach. Jedna mutacja w genie Mfrp powoduje chorobę zwaną barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki, która prowadzi do postępującego zwyrodnienia siatkówki. Drugi, w genie Rpe65, jest powiązany ze ślepotą obserwowaną u ludzi w przypadku choroby zwanej wrodzoną ślepotą Lebera (LCA).

W obu przypadkach eVLP skorygowały mutację w aż 20% komórek siatkówki zwierząt, częściowo przywracając im wzrok.

Grupa badawcza wykazała również, że eVLP wyposażone w najlepsze maszyny do edycji mogą skutecznie edytować geny w mózgach żywych myszy. Prawie połowa wszystkich komórek w korze mózgu, które otrzymały maszynę do edycji, wykazała edycję genu.

„W środowisku zajmującym się edycją genów w dużej mierze zgadza się się z tym, że w przyszłości maszyny do edycji genów powinny ostatecznie być dostarczane w postaci białek, aby zminimalizować potencjalne skutki uboczne, a teraz pokazaliśmy skuteczny sposób, aby to osiągnąć” – powiedział Liu. „Planujemy nadal aktywnie pracować nad udoskonalaniem eVLP i dostosowywaniem technologii tak, aby działała na inne typy tkanek w organizmie”.