Badając wpływ wariantów DNA między ludźmi, naukowcy mogą uzyskać wgląd w genetykę chorób. Pozwala im dostosować leczenie do genetycznego składu danej osoby.

Modelowanie wariantów w konfiguracji eksperymentalnej jest powszechnym sposobem zdobywania tej wiedzy przez badaczy. System CRISPR-Cas9, szeroko stosowane narzędzie do edycji genów, pozwala naukowcom precyzyjnie zmieniać sekwencję genomu i badać wpływ tej zmienności genetycznej na funkcje komórkowe. Zrozumienie eksperymentów z edycją genomu i poprawa dokładności ich wyników ma kluczowe znaczenie dla udanych badań.

W niedawnym badaniu opublikowanym w Dziennik CRISPRNaukowcy z Mayo Clinic, Yale University, Oklahoma Medical Research University i Baylor College of Medicine zbadali system CRISPR-Cas9.

Typowy eksperyment edycji genomu składa się z trzech etapów:

1. Edycja hodowanych komórek.
2. Klonowanie komórek i selekcja klonów z zamierzoną edycją lub bez niej.
3. Porównanie klonów z zamierzoną edycją lub bez niej.

Linia klonalna to grupa komórek lub organizmów o tym samym składzie genetycznym. Linie klonalne są niezbędne w badaniach, ponieważ zapewniają spójne i powtarzalne źródło genetycznie identycznych komórek lub organizmów do eksperymentów.

Klony z zamierzonymi zmianami i bez nich są identycznymi lub bardzo podobnymi genotypami, z wyjątkiem indukowanej mutacji.

„Podejście to jest często podkreślane jako szczególnie rygorystyczne i potężne, ponieważ umożliwia porównywanie skutków pojedynczych mutacji w identycznym podłożu genetycznym” – wyjaśnia główny autor dr Alexej Abyzov, badacz z Wydziału Ilościowych Nauk o Zdrowiu w Mayo Clinic Centrum Medycyny Zindywidualizowanej. „Jednak genomy wybranych klonów mogą być różne, co narusza założenie dopasowania (z wyjątkiem edycji) genomu w porównywanych klonach”.

Zespół przeprowadził trzy niezależne eksperymenty edycji CRISPR-Cas9 i wykorzystał sekwencjonowanie całego genomu do analizy zakresu różnic genomowych w klonach. Po namnożeniu wielu klonów zbadali zmiany liczby kopii somatycznych (tj. duże zmiany strukturalne w genomie) i warianty pojedynczych nukleotydów (tj. mutacje punktowe) w każdym klonie.

Rzadko znajdowali edycje niezgodne z celem, rodzaj niezamierzonej zmiany genetycznej występującej, gdy narzędzia do edycji genów omyłkowo edytują gen lub sekwencję, która nie była zamierzonym celem.

Jednak wykryli setki do tysięcy pojedynczych mutacji nukleotydowych charakterystycznych dla każdego klonu. Klony różniły się również odmianami liczby kopii, takimi jak usunięcia i duplikacje. Niektóre z nich miały rozmiar od kilku kilozasad (1000 kolejnych nukleotydów) do megazasad (1 000 000 kolejnych nukleotydów).

„Zmiany liczby kopii stanowią największe źródło rozbieżności genomowych wśród klonów” – mówi dr Arijit Panda, pracownik naukowy Mayo Clinic i pierwszy autor badania. „Nasze badanie pokazuje, że klony kultur wybrane po eksperymentach z edycją DNA nie mają takich samych lub bardzo podobnych genotypów, a fizyczna ekspresja genu może różnić się od zamierzonych zmian”.

Aby badacze mogli poprawnie zinterpretować eksperymenty z edycją DNA i pokazać miarodajne porównanie między edytowanymi liniami, autorzy badania zalecają:

• Przeszukiwanie klonów pod kątem mutacji i zmian dużej liczby kopii nabytych w hodowli w celu określenia największego źródła rozbieżności genomowej między liniami klonalnymi.
• Wykluczenie z rozważań klonów ze zmianami lub mutacjami o dużej liczbie kopii, które mogą mieć konsekwencje funkcjonalne.
• Porównanie mieszanki wielu nieedytowanych klonów z klonami edytowanymi w celu osłabienia możliwego efektu mutacji w każdym klonie.

Dr Abyzov mówi, że potrzebne są dalsze badania, aby określić najlepszą i najbardziej opłacalną strategię badań przesiewowych przed włączeniem tych zaleceń do badań nad edycją genów CRISPR-Cas9 w Mayo Clinic.