Naukowcy tworzą superminigen SMN jako narzędzie do badania SMA
Zespół naukowców z Iowa stworzył super minigen — mały fragment genu używany jako narzędzie do badania manipulacji genetycznych — który podsumowuje podstawowe cechy naturalnego SMN1 I SMN2 geny powiązane z rdzeniowym zanikiem mięśni (SMA) i jego ciężkością.
Naukowcy zauważyli, że jednym z najważniejszych zastosowań tego nowego superminigenu może być modelowanie różnych mutacji chorobotwórczych w celu zbadania ich wpływu na procesy biologiczne w różnych typach komórek.
„Po wprowadzeniu takich mutacji do super minigenu ich skutki będzie można monitorować na wielu poziomach” – napisali naukowcy.
Zdaniem zespołu można go również wykorzystać do wykrywania związków terapeutycznych zwiększających produkcję białka SMN, której u osób chorych na SMA brakuje.
Ich badanie „Super minigen z krótkim promotorem i skróconymi intronami podsumowuje podstawowe cechy regulacji transkrypcji i splicingu SMN1 I SMN2 geny” – ukazał się w czasopiśmie Badania kwasów nukleinowych.
Super minigen podsumowuje cechy genów SMN1 i SMN2
Mutacje w SMN1 gen powoduje większość przypadków SMA, zaburzenia charakteryzującego się postępującym osłabieniem i zanikiem mięśni, znanym jako atrofia. Takie mutacje skutkują niewielką ilością białka SMN lub jego brakiem, co prowadzi do postępującej utraty neuronów ruchowych, komórek nerwowych kontrolujących ruch.
Komórki też mają sekundę SMN2 gen kodujący białko SMN i jest prawie identyczny z SMN1. Ogólnie rzecz biorąc, liczba SMN2 kopie genów są powiązane z pewną produkcją SMN, a pacjenci z większą liczbą kopii mają łagodniejszy typ SMA.
Wszystkie geny kodujące białka mają wzdłuż nici DNA tak zwane eksony i introny: eksony niosą instrukcje dla białka, a introny nie.
Na pierwszym etapie produkcji białka enzym zwany polimerazą RNA kopiuje, czyli transkrybuje, informację z genu na poprzedzający sygnał RNA, zasadniczo tworząc wstępny szkic. Następnie w procesie zwanym splicingiem introny są usuwane, tworząc dojrzały informacyjny RNA, czyli mRNA, który jest następnie odczytywany lub ulegany translacji przez maszynerię komórkową w celu wytworzenia białka.
Splicing alternatywny to naturalny proces, w którym niektóre eksony są wykluczane, aby pojedynczy gen mógł kodować więcej niż jedno białko. Jednakże w związku z pojedynczymi zmianami w SMN2sekwencji DNA, alternatywny splicing wyklucza ekson numer 7, tworząc krótszą wersję białka SMN, która ulega szybkiej degradacji. W związku z tym nie jest w stanie w pełni zrekompensować SMN1 strata.
Dwie zatwierdzone terapie modyfikujące przebieg SMA – Spinraza (nusinersen) i Evrysdi (risdiplam) – działają poprzez zapobieganie SMN2 wykluczenie eksonu 7, zwiększając w ten sposób produkcję SMN.
Aby zrozumieć szczegóły SMN2 ekspresję lub aktywność i powiązane zdarzenia splicingu, naukowcy z Iowa State University stworzyli SMN2 super minigen na kolistej nici DNA, który podsumowuje wszystkie istotne cechy natury SMN2 gen.
Ten superminigen zawierał eksony zawierające informację o białku SMN, mianowicie 1, 2A, 2B, 3, 4, 5, 6, 7 i 8. Miał również krótsze segmenty intronów, ale sekwencje DNA obok eksonów dokładnie odpowiadały sekwencjom z naturalny SMN2. Minigen zachował promotor, segment przed eksonem 1, gdzie wiąże się polimeraza RNA.
Naukowcy nazywają nowe narzędzie „wyjątkowym i potężnym”
Następnie zespół wstawił super minigen do komórek ludzkich, aby zbadać ekspresję RNA i wygenerowane na jego podstawie wzorce splicingu SMN2.
Wyniki pokazały, że SMN2 super minigen wytwarzał mRNA pełnej długości jako produkt dominujący, po którym następował mRNA bez eksonu 7, jak widać u pacjentów z SMA. W trzecim najliczniejszym mRNA brakowało obu eksonów 5 i 7. Naukowcy potwierdzili, że minigen był w stanie wytwarzać białko SMN.
Eksperymenty wykazały, że usunięcie segmentów DNA z regionu promotorowego minigenu nie miało wpływu na splicing. Mimo to niektóre segmenty miały kluczowe znaczenie dla poziomu ekspresji genów. Stwierdzono również, że nadekspresja białka SMN powoduje wykluczenie eksonu 3 w naturze SMN2 jak również SMN1co wpłynęło na zdarzenia splicingu w dół.
Splicing wielu eksonów w obu SMN2 minigen i naturalny SMN1 I SMN2 stwierdzono, że jest regulowany przez dwa białka, SRSF3 i DHX9. Co więcej, ekspresja SMN2 minigen pozbawiony eksonu 7 w porównaniu z pełną długością SMN2doprowadziło do alternatywnych zdarzeń splicingu dla naturalnego SMN1 I SMN2.
Super minigen, który tu opisujemy, stanowi unikalne, potężne i łatwe w użyciu narzędzie do odkrywania elementów regulacyjnych związanych z kilkoma aspektami metabolizmu RNA, a także do zastosowań terapeutycznych i diagnostycznych.
Następnie naukowcy zweryfikowali superminigen jako system reporterowy do monitorowania poziomów białka SMN po korekcji splicingu za pomocą terapii modyfikujących przebieg choroby SMA. Wprowadzili minigen do komórek o cząsteczce niemal identycznej z nusinersenem, aktywnym składnikiem leku Spinraza. Poziomy białka SMN były znacząco zwiększone w porównaniu z cząsteczką kontrolną.
Wreszcie stworzono super minigen, aby odtworzyć naturalne wzorce łączenia SMN1 który niósł mutację związaną z ciężką postacią SMA. Mutacja ta zlokalizowana jest w intronie 7, co prowadzi do wykluczenia eksonu 7 SMN1. Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowali całkowite pominięcie eksonu 7 i zachowanie intronu 7 we wszystkich testowanych typach komórek. Jednakże dodatkowe wzory splicingu różniły się w zależności od rodzaju użytej komórki.
„Nasze odkrycia są znaczące, biorąc pod uwagę fakt, że brak jest informacji na temat specyficznego tkankowo splicingu tego patogenu [disease-causing] mutacja jest obecnie dostępna” – napisali naukowcy.
„Super minigen, o którym tu piszemy, stanowi unikalne, potężne i łatwe w użyciu narzędzie do odkrywania elementów regulacyjnych związanych z kilkoma aspektami metabolizmu RNA, a także do zastosowań terapeutycznych i diagnostycznych” – podsumowali.
