Nowa metoda może śledzić zmiany w ekspresji genów żywych komórek w dłuższych okresach czasu. Metoda oparta na spektroskopii Ramana nie uszkadza komórek i może być wykonywana wielokrotnie. Źródło: Wiadomości MIT; iStock

Nowy MIT-opracowana metoda łączy spektroskopię Ramana z nauczanie maszynowe do nieinwazyjnego śledzenia ekspresji genów w komórkach w czasie. Technika ta umożliwia szczegółowe badanie różnicowania komórek i ma potencjalne zastosowania w badaniach nad nowotworami, biologii rozwoju i diagnostyce.

Kolejność wszystkich RNA w komórce może ujawnić wiele informacji na temat funkcji tej komórki i tego, co robi w danym momencie. Jednak proces sekwencjonowania niszczy komórkę, co utrudnia badanie zachodzących zmian w ekspresji genów.

Alternatywne podejście opracowane w MIT mogłoby umożliwić badaczom śledzenie takich zmian przez dłuższy czas. Nowa metoda, oparta na nieinwazyjnej technice obrazowania zwanej spektroskopią Ramana, nie uszkadza komórek i może być stosowana wielokrotnie.

Stosując tę ​​technikę, naukowcy wykazali, że mogą monitorować embrionalne komórki macierzyste różnicujące się na kilka innych typów komórek w ciągu kilku dni. Technika ta mogłaby umożliwić badanie długotrwałych procesów komórkowych, takich jak progresja nowotworu czy rozwój embrionalny, a pewnego dnia mogłaby zostać wykorzystana do diagnostyki nowotworu i innych chorób.

„Dzięki obrazowaniu ramanowskiemu można zmierzyć znacznie więcej punktów czasowych, co może być ważne w badaniu biologii nowotworów, biologii rozwoju i szeregu chorób zwyrodnieniowych” – mówi Peter So, profesor inżynierii biologicznej i mechanicznej w MIT, dyrektor działu MIT Laser Biomedical Research Center i jeden z autorów pracy.

Koseki Kobayashi-Kirschvink, postdoc w MIT oraz Broad Institute of Harvard i MIT, jest głównym autorem badania, które zostało niedawno opublikowane w czasopiśmie Biotechnologia Przyrody. Starsi autorzy artykułu to Tommaso Biancalani, były naukowiec z Broad Institute; Jian Shu, adiunkt w Harvard Medical School i członek stowarzyszony Broad Institute; oraz Aviv Regev, wiceprezes wykonawczy Genentech Research and Early Development, który jest na urlopie ze stanowisk wykładowców w Broad Institute i na Wydziale Biologii MIT.

Obrazowanie ekspresji genów

Spektroskopia Ramana to nieinwazyjna technika, która ujawnia skład chemiczny tkanek lub komórek poprzez świecenie na nie światła bliskiej podczerwieni lub światła widzialnego. Laserowe Centrum Badań Biomedycznych MIT pracuje nad biomedyczną spektroskopią Ramana od 1985 roku, a niedawno So i inni pracownicy ośrodka opracowali techniki oparte na spektroskopii Ramana, które można wykorzystać do diagnozowania raka piersi lub pomiaru poziomu glukozy we krwi.

Jednak sama spektroskopia Ramana nie jest wystarczająco czuła, aby wykryć tak małe sygnały, jak zmiany w poziomach poszczególnych cząsteczek RNA. Aby zmierzyć poziom RNA, naukowcy zazwyczaj stosują technikę zwaną sekwencjonowaniem RNA pojedynczych komórek, która może ujawnić geny aktywne w różnych typach komórek w próbce tkanki.

W ramach tego projektu zespół z MIT starał się połączyć zalety sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek i spektroskopii Ramana, szkoląc model obliczeniowy do translacji sygnałów Ramana na stany ekspresji RNA.

„Sekwencjonowanie RNA dostarcza niezwykle szczegółowych informacji, ale jest destrukcyjne. Raman jest metodą nieinwazyjną, ale nic nie mówi o RNA. Dlatego ideą tego projektu było wykorzystanie uczenia maszynowego do połączenia zalet obu modalności, co umożliwiło zrozumienie dynamiki profili ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki w czasie” – mówi Kobayashi-Kirschvink.

Aby wygenerować dane do wyszkolenia swojego modelu, naukowcy potraktowali mysie fibroblasty – rodzaj komórek skóry – czynnikami, które przeprogramowują je tak, aby stały się pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi. Podczas tego procesu komórki mogą również przekształcić się w kilka innych typów komórek, w tym komórki nerwowe i nabłonkowe.

Korzystając ze spektroskopii Ramana, naukowcy zobrazowali różnicowanie komórek w 36 punktach czasowych przez 18 dni. Po wykonaniu każdego zdjęcia naukowcy analizowali każdą komórkę za pomocą hybrydyzacji fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH), którą można wykorzystać do wizualizacji określonych cząsteczek RNA w komórce. W tym przypadku szukali cząsteczek RNA kodujących dziewięć różnych genów, których wzorce ekspresji różnią się w zależności od typu komórek.

Te dane smFISH mogą następnie działać jako łącznik między danymi obrazowania Ramana a danymi sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Aby dokonać tego powiązania, naukowcy najpierw wytrenowali model głębokiego uczenia się, aby przewidywać ekspresję tych dziewięciu genów na podstawie obrazów ramanowskich uzyskanych z tych komórek.

Następnie wykorzystali program obliczeniowy o nazwie Tangram, opracowany wcześniej w Broad Institute, aby powiązać wzorce ekspresji genów smFISH z profilami całego genomu, które uzyskali w wyniku sekwencjonowania jednokomórkowego RNA na próbkach komórek.

Następnie badacze połączyli te dwa modele obliczeniowe w jeden, który nazwali Raman2RNA i który umożliwia przewidywanie całych profili genomowych poszczególnych komórek na podstawie obrazów ramanowskich komórek.

Śledzenie różnicowania komórek

Naukowcy przetestowali algorytm Raman2RNA, śledząc embrionalne komórki macierzyste myszy w miarę ich różnicowania się w różne typy komórek. Robili obrazy ramanowskie komórek cztery razy dziennie przez trzy dni i wykorzystali swój model obliczeniowy do przewidzenia odpowiednich profili ekspresji RNA w każdej komórce, co potwierdzili, porównując je z pomiarami sekwencjonowania RNA.

Korzystając z tego podejścia, badacze byli w stanie zaobserwować przejścia zachodzące w poszczególnych komórkach podczas różnicowania się z embrionalnych komórek macierzystych w bardziej dojrzałe typy komórek. Wykazali także, że mogą śledzić zmiany genomiczne zachodzące w trakcie przeprogramowywania mysich fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste w okresie dwóch tygodni.

„To dowód, że obrazowanie optyczne dostarcza dodatkowych informacji, które pozwalają bezpośrednio śledzić pochodzenie komórek i ewolucję ich transkrypcji” – mówi So.

Naukowcy planują teraz zastosować tę technikę do badania innych typów populacji komórek zmieniających się w czasie, takich jak komórki starzejące się i komórki nowotworowe. Obecnie pracują z komórkami hodowanymi w naczyniu laboratoryjnym, ale mają nadzieję, że w przyszłości to podejście można opracować jako potencjalną metodę diagnostyczną do stosowania u pacjentów.

„Jedną z największych zalet metody Ramana jest to, że jest to metoda niewymagająca etykietowania. To jeszcze daleka droga, ale istnieje potencjał translacji na ludzi, czego nie dałoby się osiągnąć przy użyciu istniejących inwazyjnych technik pomiaru profili genomowych” – mówi Jeon Woong Kang, naukowiec z MIT, który jest także autorem badania.

Odniesienie: „Przewidywanie profili ekspresji jednokomórkowych RNA w żywych komórkach za pomocą mikroskopii ramanowskiej z Raman2RNA” autorstwa Koseki J. Kobayashi-Kirschvink, Charles S. Comiter, Shreya Gaddam, Taylor Joren, Emanuelle I. Grody, Johain R. Ounadjela, Ke Zhang, Baoliang Ge, Jeon Woong Kang, Ramnik J. Xavier, Peter TC So, Tommaso Biancalani, Jian Shu i Aviv Regev, 10 stycznia 2024 r., Biotechnologia Przyrody.
DOI: 10.1038/s41587-023-02082-2

Badania zostały sfinansowane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki Stypendium podoktorskie dla badaczy zagranicznych, Overseas Postdoctoral Fellowship Naito Foundation, MathWorks Fellowship, Helen Hay Whitney Foundation, USA Narodowy Instytut ZdrowiaAmerykański Narodowy Instytut Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii, HubMap, Instytut Medyczny Howarda Hughesa i Obserwatorium Komórkowe Klarman.