HiDEF-seq, przełomowa technika opracowana przez NYU Langone Health, umożliwia wczesną identyfikację DNA zmiany poprzedzające mutacje, pogłębiające wiedzę na temat chorób genetycznych i starzenia się.

Mutacje to zmiany w molekularnych „literach”, które składają się na kod DNA, który służy jako plan dla wszystkich żywych komórek. Podczas gdy niektóre z tych zmian mają minimalny wpływ, inne mogą prowadzić do chorób, takich jak rak. Ostatnie badanie wprowadziło nową technikę, zwaną HiDEF-seq, która może precyzyjnie wykrywać wczesne zmiany molekularne w kodzie DNA, które występują przed mutacjami.

Autorzy badania twierdzą, że ich technika — HiDEF-seq, skrót od Hairpin Duplex Enhanced Fidelity Sequencing — może pogłębić naszą wiedzę na temat podstawowych przyczyn mutacji zarówno w zdrowych komórkach, jak i w komórkach nowotworowych, a także na temat tego, w jaki sposób zmiany genetyczne naturalnie kumulują się w ludzkich komórkach w miarę starzenia się człowieka.

Praca pod przewodnictwem zespołu naukowców z NYU Langone Health, przy współudziale współpracowników z Ameryki Północnej i Danii, ma na celu wyjaśnienie najwcześniejszych etapów powstawania mutacji w DNA.

Zrozumienie struktury DNA i powstawania mutacji

Nowe badanie opiera się na zrozumieniu, że DNA składa się z dwóch nici liter molekularnych, czyli zasad. Każda nić składa się z czterech rodzajów liter: adeniny (A), tyminy (T), guaniny (G) i cytozyny (C). Zasady każdej nici łączą się w pary z zasadami w drugiej nici w określonym wzorze, przy czym As łączy się z T, a G łączy się z C.

Umożliwia to replikację kodu DNA i jego dokładne przekazywanie z jednego pokolenia komórek do następnego. Co ważne, mutacje to zmiany w kodzie DNA, które są obecne w obu niciach DNA. Na przykład para zasad G i C, z G na jednym nici sparowanym z C na drugim nici, może zmutować do pary zasad A i T.

Naukowcy twierdzą jednak, że większość mutacji ma swoje źródło w zmianach DNA, które występują tylko w jednym z dwóch łańcuchów DNA. Tego typu zmian w pojedynczych łańcuchach, takich jak niedopasowana para zasad G i T, nie da się dokładnie zidentyfikować za pomocą dotychczas stosowanych technik badawczych.

Zmiany te mogą wystąpić, gdy nić DNA nie jest poprawnie kopiowana podczas replikacji, gdy komórka dzieli się na dwie komórki lub gdy jedna z dwóch nici DNA jest uszkodzona przez ciepło lub inne substancje chemiczne w organizmie. Jeśli te zmiany jednoniciowego DNA nie zostaną naprawione przez komórkę, istnieje ryzyko, że zmiany te staną się trwałymi mutacjami dwuniciowymi.

Możliwości wykrywania HiDEF-seq

Publikowanie w czasopiśmie Naturawykazano, że technika HiDEF-seq wykrywa mutacje dwuniciowe o wyjątkowo wysokim dokładnośćz szacunkową wartością jednego błędu zapisu na 100 bilionów analizowanych par zasad. Co więcej, HiDEF-seq wykrył zmiany w kodzie literowym DNA, gdy były obecne tylko na jednym z dwóch pasm DNA, zanim stały się trwałymi mutacjami dwuniciowymi.

„Nasza nowa technika sekwencjonowania HiDEF-seq pozwala nam dostrzec najwcześniejsze ślady zmian molekularnych w DNA, gdy zmiany te dotyczą jedynie pojedynczych nici DNA” – powiedział starszy autor badania, dr n. med. Gilad Evrony, członek kierownictwa Centrum Genetyki Człowieka i Genomiki w Szkole Medycznej Grossman na Uniwersytecie Nowojorskim.

Obszary badań i eksperymenty z wykorzystaniem HiDEF-seq

Ponieważ wiadomo, że osoby z zespołami genetycznymi związanymi z rakiem mają wyższy wskaźnik mutacji w swoich komórkach niż komórki osób bez predyspozycji do raka, badacze rozpoczęli swoje eksperymenty od opisania zmian DNA w zdrowych komórkach osób z tymi zespołami. Konkretnie, badacze pracowali ze zdrowymi komórkami osób z polipowatością związaną z korektą polimerazy (PPAP), dziedzicznym schorzeniem związanym ze zwiększonym ryzykiem raka jelita grubego i wrodzonym niedoborem naprawy niedopasowań (CMMRD), innym dziedzicznym schorzeniem, które zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia kilku nowotworów u dzieci.

Korzystając z HiDEF-seq, badacze odkryli większą liczbę zmian jednoniciowego DNA w swoich komórkach, takich jak T sparowane z C zamiast oryginalnego G sparowanego z C, niż w komórkach od osób, które nie miały żadnego z tych zespołów. Co więcej, wzór tych zmian jednoniciowych był podobny do wzoru obserwowanego w mutacjach dwuniciowego DNA u osób z każdym z tych zespołów.

Późniejsze eksperymenty przeprowadzono na ludzkich plemnikach, które są znane z tego, że mają jedne z najniższych wskaźników mutacji dwuniciowych spośród wszystkich typów ludzkich komórek. Naukowcy odkryli, że wzór uszkodzeń chemicznych, zwany deaminacją cytozyny, obserwowany przez HiDEF-seq w pojedynczych partiach DNA w plemnikach, ściśle odpowiadał uszkodzeniom obserwowanym w DNA krwi celowo uszkodzonym przez ciepło. To, jak twierdzą naukowcy, sugeruje, że dwa wzory uszkodzeń chemicznych DNA, jeden naturalny i drugi indukowany, zachodzą w podobny sposób.

„Nasze badanie stanowi podstawę do wykorzystania techniki HiDEF-seq w przyszłych eksperymentach, aby zmienić nasze zrozumienie tego, jak powstają uszkodzenia DNA i mutacje” — powiedział Evrony, który jest również adiunktem w Katedrze Pediatrii i Katedrze Neurologii i Fizjologii w NYU Grossman School of Medicine. Zmiany jednoniciowe w DNA zachodzą nieustannie, gdy komórki dzielą się i mnożą, a podczas gdy warstwy mechanizmów naprawczych naprawiają większość zmian, niektóre przechodzą i stają się mutacjami.

„Naszym długoterminowym celem jest wykorzystanie HiDEF-seq do stworzenia kompleksowego katalogu wzorców niezgodności i uszkodzeń jednoniciowego DNA, które pomogą wyjaśnić znane wzorce mutacji dwuniciowych” — powiedział Evrony. „W przyszłości mamy nadzieję połączyć profilowanie uszkodzeń jednoniciowego DNA, uzyskane z HiDEF-seq, z wynikającymi z uszkodzeń mutacjami dwuniciowymi, aby lepiej zrozumieć i monitorować codzienne skutki narażenia na czynniki środowiskowe na DNA”.

Genetycy szacują, że w każdej ludzkiej komórce jest około 12 miliardów zasad lub pojedynczych liter DNA, które mogą zostać uszkodzone lub niedopasowane, ponieważ istnieją dwie kopie kodu genetycznego, przy czym jedna kopia jest dziedziczona od każdego rodzica. Każda z tych kopii składa się z dwuniciowego DNA obejmującego 3 miliardy par zasad. Evrony mówi, że każda pozycja zasad w kodzie genetycznym jest prawdopodobnie uszkodzona lub zmutowana w pewnym momencie życia jednostki w co najmniej niektórych komórkach.

Odniesienie: „DNA mismatch and damage patterns revealed by single-molecule sequencing” autorstwa Mei Hong Liu, Benjamina M. Costy, Emilii C. Bianchini, Uny Choi, Rachel C. Bandler, Emilie Lassen, Marty Grońskiej-Pęski, Adama Schwinga, Zachary’ego R. Murphy’ego, Daniela Rosenkjæra, Shany’ego Picciotto, Vanessy Bianchi, Lucie Stengs, Melissy Edwards, Nuno Miguela Nunesa, Caitlin A. Loh, Tiny K. Truong, Randalla E. Branda, Tomiego Pastinena, J. Richarda Wagnera, Anne-Bine Skytte, Uri Tabori, Jonathana E. Shoaga i Gilada D. Evrony’ego, 12 czerwca 2024 r., Natura.
DOI: 10.1038/s41586-024-07532-8

Finansowanie badania zapewniła Narodowe Instytuty Zdrowia dotacje UG3NS132024, R21HD105910, DP5OD028158, T32AG052909, F32AG076287 i P30CA016087. Dodatkowe wsparcie finansowe zapewniły fundacje Sontag Foundation, Pew Foundation i Jacob Goldfield Foundation.

Evrony i NYU złożyli wniosek patentowy dotyczący metody HiDEF-seq.

Evrony posiada udziały w firmach zajmujących się sekwencjonowaniem DNA: Illumina, Pacific Biosciences i Oxford Nanopore Technologies, których niektóre produkty zostały dostosowane do użytku w tym badaniu. Wszystkie te ustalenia są zarządzane zgodnie z polityką i praktykami NYU Langone Health.

Oprócz Evrony, inni badacze z NYU Langone zaangażowani w to badanie to współautorzy główni Mei-Hong Liu i Benjamin Costa oraz współautorzy Emilia Bianchini, Una Choi, Rachel Bandler, Marta Gronska-Peski, Adam Schwing, Zachary Murphy, Caitlin Loh i Tina Truong. Inni współbadacze badania to Emilie Lassen, Daniel Rosenkjaer, Anne-Bine Skytte z Cryos International Sperm and Egg Bank w Kopenhadze w Danii; Shany Picciotto i Jonathan Shoag z Case Western Reserve University w Cleveland w stanie Ohio; Vanessa Bianchi, Lucie Stengs, Melissa Edwards, Nuno Miguel Nunes i Uri Tabori z The Hospital for Sick Children w Toronto w Kanadzie; Randall Brand z University of Pittsburgh w Pensylwanii; Tomi Pastinen z Children’s Mercy Kansas City w stanie Missouri; i Richard Wagner z Universite de Sherbrooke w Kanadzie.