Ludzki genom zawiera około 23 000 genów, ale tylko część z nich jest włączana w komórce w danym momencie. Złożona sieć elementów regulacyjnych kontrolujących ekspresję genów obejmuje regiony genomu zwane wzmacniaczami, które często są zlokalizowane daleko od genów, które regulują.

Odległość ta może utrudniać mapowanie złożonych interakcji między genami i wzmacniaczami. Aby temu zaradzić, badacze z MIT opracowali nową technikę, która pozwala im obserwować czas aktywacji genu i wzmacniacza w komórce. Kiedy gen zostaje włączony mniej więcej w tym samym czasie co konkretny wzmacniacz, silnie sugeruje to, że wzmacniacz kontroluje ten gen.

Dowiedzenie się więcej o tym, które wzmacniacze kontrolują które geny w różnych typach komórek, może pomóc naukowcom w identyfikacji potencjalnych celów leków w leczeniu zaburzeń genetycznych. Badania genomu zidentyfikowały mutacje w wielu regionach niekodujących białek, które są powiązane z różnymi chorobami. Czy mogą to być nieznane wzmacniacze?

„Kiedy ludzie zaczynają używać technologii genetycznej do identyfikowania regionów chromosomów zawierających informacje o chorobie, większość z tych miejsc nie odpowiada genom. Podejrzewamy, że odpowiadają one wzmacniaczom, które mogą być dość odległe od promotora, dlatego bardzo ważna jest umiejętność ich zidentyfikowania” – mówi Phillip Sharp, emerytowany profesor MIT Institute i członek Instytutu Kocha ds. Integracyjnych Badań nad Rakiem w MIT.

Sharp jest głównym autorem nowego badania, które ukazuje się dzisiaj w: Natura. Głównym autorem artykułu jest asystent badawczy MIT DB Jay Mahat.

Polowanie na eRNA

Mniej niż 2 procent ludzkiego genomu składa się z genów kodujących białka. Pozostała część genomu zawiera wiele elementów kontrolujących czas i sposób ekspresji tych genów. Wzmacniacze, o których uważa się, że włączają geny poprzez fizyczny kontakt z regionami promotora genu poprzez przejściowe tworzenie kompleksu, odkryto około 45 lat temu.

Niedawno, w 2010 roku, naukowcy odkryli, że wzmacniacze te ulegają transkrypcji na cząsteczki RNA, znane jako wzmacniacz RNA lub eRNA. Naukowcy podejrzewają, że transkrypcja ta zachodzi, gdy wzmacniacze aktywnie oddziałują z genami docelowymi. Zwiększyło to możliwość, że pomiar poziomów transkrypcji eRNA może pomóc naukowcom w określeniu, kiedy wzmacniacz jest aktywny, a także w jakie geny jest ukierunkowany.

„Te informacje są niezwykle ważne dla zrozumienia, w jaki sposób zachodzi rozwój oraz w jaki sposób nowotwory zmieniają swoje programy regulacyjne i aktywują procesy prowadzące do odróżnicowania i wzrostu przerzutów” – mówi Mahat.

Jednakże tego rodzaju mapowanie okazało się trudne do wykonania, ponieważ eRNA jest produkowane w bardzo małych ilościach i nie utrzymuje się długo w komórce. Ponadto eRNA nie posiada modyfikacji zwanej ogonem poli-A, czyli „haczykiem”, którego używa większość technik do wyciągania RNA z komórki.

Jednym ze sposobów wychwycenia eRNA jest dodanie nukleotydu do komórek, który zatrzymuje transkrypcję po włączeniu do RNA. Nukleotydy te zawierają również znacznik zwany biotyną, który można wykorzystać do wyłowienia RNA z komórki. Jednak ta obecna technika działa tylko w przypadku dużych pul komórek i nie dostarcza informacji o poszczególnych komórkach.

Podczas burzy mózgów na temat nowych sposobów przechwytywania eRNA Mahat i Sharp rozważali zastosowanie chemii kliknięć – techniki, którą można zastosować do połączenia dwóch cząsteczek, jeśli każda z nich zostanie oznaczona „uchwytami kliknięcia”, które mogą razem reagować.

Naukowcy zaprojektowali nukleotydy oznaczone uchwytem jednym kliknięciem, a gdy nukleotydy te zostaną włączone do rosnących nici eRNA, nici można wyłowić za pomocą znacznika zawierającego uchwyt uzupełniający. Umożliwiło to badaczom wychwycenie eRNA, a następnie jego oczyszczenie, amplifikację i sekwencjonowanie. Na każdym etapie następuje utrata części RNA, ale Mahat szacuje, że z danej komórki można z powodzeniem wyciągnąć około 10 procent eRNA.

Korzystając z tej techniki, badacze uzyskali migawkę wzmacniaczy i genów, które w danym momencie ulegają aktywnej transkrypcji w komórce.

„Chcesz móc określić w każdej komórce aktywację transkrypcji z elementów regulatorowych i odpowiadającego im genu. Trzeba to zrobić w pojedynczej komórce, ponieważ tam można wykryć synchronizację lub asynchronię między elementami regulacyjnymi a genami” – mówi Mahat.

Czas ekspresji genów

Demonstrując swoją technikę na embrionalnych komórkach macierzystych myszy, naukowcy odkryli, że mogą w przybliżeniu obliczyć, kiedy dany region zaczyna ulegać transkrypcji, na podstawie długości nici RNA i szybkości polimerazy (enzymu odpowiedzialnego za transkrypcję) – tj. , jak daleko polimeraza dokonuje transkrypcji na sekundę. Pozwoliło im to określić, które geny i wzmacniacze ulegały transkrypcji mniej więcej w tym samym czasie.

Naukowcy wykorzystali to podejście do bardziej szczegółowego niż było to wcześniej możliwe określenia czasu ekspresji genów cyklu komórkowego. Udało im się także potwierdzić kilka zestawów znanych par gen-wzmacniacz i wygenerować listę około 50 000 możliwych par wzmacniacz-gen, które mogą teraz spróbować zweryfikować.

Dowiedzenie się, które wzmacniacze kontrolują, które geny okażą się cenne w opracowywaniu nowych metod leczenia chorób o podłożu genetycznym. W zeszłym roku amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków zatwierdziła pierwszą terapię genową w leczeniu anemii sierpowatokrwinkowej, która działa poprzez interakcję ze wzmacniaczem, który powoduje aktywację genu globiny płodowej, zmniejszając wytwarzanie sierpowatych krwinek.

Zespół MIT stosuje obecnie to podejście do innych typów komórek, ze szczególnym uwzględnieniem chorób autoimmunologicznych. Współpracując z naukowcami z Bostońskiego Szpitala Dziecięcego, badają mutacje komórek odpornościowych powiązane z toczniem, z których wiele znajduje się w niekodujących regionach genomu.

„Nie jest jasne, na które geny wpływają te mutacje, dlatego zaczynamy analizować geny, które te domniemane wzmacniacze mogą regulować i w jakich typach komórek te wzmacniacze są aktywne” – mówi Mahat. „Jest to narzędzie do tworzenia map genów do wzmacniaczy, które mają fundamentalne znaczenie w zrozumieniu biologii, a także stanowią podstawę zrozumienia chorób”.

Wyniki tego badania dostarczają również dowodów na teorię, którą Sharp niedawno opracował wraz z profesorami z MIT Richardem Youngiem i Arupem Chakraborty, że transkrypcja genów jest kontrolowana przez bezbłonowe kropelki zwane kondensatami. Kondensaty te składają się z dużych skupisk enzymów i RNA, co według Sharpa może obejmować eRNA wytwarzany w miejscach wzmacniacza.

„Wyobrażamy sobie, że komunikacja między wzmacniaczem a promotorem jest strukturą przejściową typu kondensatu, której częścią jest RNA. To ważny element pracy w budowaniu wiedzy na temat aktywności RNA ze wzmacniaczy” – mówi.

Badania zostały sfinansowane przez Narodowy Instytut Raka, Narodowe Instytuty Zdrowia oraz nagrodę Postdoctoral Transition Award Fundacji Emerald.