Syntetyczny zarodek ludzki podobny do blastocysty, zwany blastoidem, wykazujący obecność otaczającej warstwy komórek pozazarodkowych, jamy przypominającej blastocel, komórki epiblastu (zielone, dające początek przyszłemu zarodkowi) i komórki hipoblastyczne (czerwone, dające początek przyszłemu zarodkowi) przyszła owodni). iMiGSeq zastosowano do sekwencjonowania mtDNA w pojedynczym blastoidzie w celu modelowania dynamiki mutacji mtDNA podczas embriogenezy człowieka. Źródło: © 2023 KAUST; Mo Li

Wysokowydajna technologia sekwencjonowania genomu pojedynczej mitochondrialnej pojedynczej komórki, znana jako iMiGseq, dostarczyła nowych informacji na temat mutacji mitochondrialnych[{” attribute=””>DNA (mtDNA) and offers a platform for assessing mtDNA editing strategies and genetic diagnosis of embryos prior to their implantation.

The development of a new high-throughput single-cell single-mitochondrial genome sequencing technology, called iMiGseq, has enabled researchers to uncover previously hidden mutations in mitochondrial DNA (mtDNA) that cause maternally inherited diseases. By allowing for complete sequencing of individual mtDNA in single cells, the iMiGseq method has provided a platform for assessing mtDNA editing strategies, genetic diagnosis of embryos prior to implantation, and understanding the links between mtDNA mutations and complex diseases. The technology has also revealed complex patterns of pathogenic mtDNA mutations, including single nucleotide variants and large structural variants, that were undetectable with conventional next-generation sequencing. Additionally, iMiGseq has shown the potential risks of unintended off-target mutations in a mitochondrial genome editing method called mitoTALEN, highlighting the need for more sensitive methods to assess the safety of editing strategies.

An international team of researchers, led by KAUST stem cell biologist Mo Li, has now quantitatively depicted the genetic maps of mtDNA in single human oocytes (immature eggs) and blastoids (stem cell-based synthetic embryos).^[1] Ujawniło to cechy molekularne rzadkich mutacji mtDNA, które powodują choroby dziedziczne po matce.

Mitochondria, „elektrownie” komórek, odgrywają kluczową rolę w komunikacji komórkowej i metabolizmie. Ludzkie mtDNA to kolisty genom zawierający 37 genów, kodujących 13 białek i niekodujący region pętli D. Mutacje heteroplazmatyczne, dziedziczone z komórek jajowych, mogą powodować choroby wrodzone, takie jak zespół Leigha odziedziczony po matce, i są związane z chorobami złożonymi o późnym początku.

„Sekwencjonowanie nowej generacji zostało wykorzystane do sekwencjonowania mtDNA i implikowanych mutacji heteroplazmatycznych jako istotnych czynników przyczyniających się do chorób metabolicznych. Jednak zrozumienie mutacji mtDNA pozostaje ograniczone ze względu na ograniczenia tradycyjnych technologii sekwencjonowania”, mówi główny autor Chongwei Bi.

„Nasza nowa metoda iMiGseq jest istotna, ponieważ umożliwia pełne sekwencjonowanie poszczególnych mtDNA w pojedynczych komórkach, umożliwiając bezstronną, wysokowydajną analizę pełnej długości mtDNA z rozdzielczością podstawową”, mówi Bi. iMiGseq rozwiązuje kilka kluczowych pytań w terenie.

Korzystając z technologii sekwencjonowania nanoporów trzeciej generacji, naukowcy scharakteryzowali heteroplazmię mtDNA w pojedynczych komórkach i opisali cechy genetyczne mtDNA w pojedynczych oocytach. Zbadali mtDNA w indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych pochodzących od pacjentów z zespołem Leigha lub neuropatią, ataksją lub barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki (NARP). Ujawniło to złożone wzorce patogennych mutacji mtDNA, w tym warianty pojedynczych nukleotydów i duże warianty strukturalne. „Byliśmy w stanie wykryć rzadkie mutacje o częstości znacznie poniżej tradycyjnego progu wykrywalności wynoszącego jeden procent”, mówi Mo Li.

W innym eksperymencie wykorzystującym nową technologię iMiGseq ujawnił potencjalne ryzyko nieoczekiwanego dużego wzrostu częstotliwości mutacji poza celem, znanych jako heteroplazmia, w metodzie edycji genomu mitochondrialnego o nazwie mitoTALEN – narzędziu do edycji genomu, które wycina określoną sekwencję w mitochondrialnym DNA. Jest stosowany do wycinania mutacji, która powoduje encefalomiopatię mitochondrialną i zespół epizodów udaropodobnych w indukowanych przez pacjenta pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

„Podkreśla to zalety analizy haplotypów mtDNA pełnej długości dla zrozumienia zmiany heteroplazmy mitochondrialnego DNA; na inne odległe warianty genetyczne mtDNA może nieumyślnie wpływać edycja genetycznie powiązanej mutacji istotnej dla choroby i istnieje potrzeba ultraczułych metod oceny bezpieczeństwa strategii edycji”, mówi Li.

Naukowcy wykorzystali również iMiGseq do analizy pojedynczych ludzkich oocytów od zdrowych dawców i pojedynczych ludzkich blastoidów, syntetycznych embrionów wykonanych z komórek macierzystych, w celu zidentyfikowania rzadkich mutacji niewykrywalnych za pomocą konwencjonalnego sekwencjonowania nowej generacji. Te mutacje heteroplazmatyczne niskiego poziomu, potencjalnie dziedziczone przez żeńską linię zarodkową, są powiązane z chorobami mitochondrialnymi i rakiem.^[2]

Metoda iMiGseq zapewnia nowatorski sposób dokładnego przedstawiania kompletnych haplotypów poszczególnych mtDNA w pojedynczych komórkach, oferując idealną platformę do wyjaśniania przyczyn chorób związanych z mutacjami mitochondrialnymi, oceny bezpieczeństwa różnych strategii edycji mtDNA i odkrywania powiązań między mutacjami mtDNA , starzenie się i rozwój złożonych chorób.

Bibliografia:

1. „Ilościowa haplotypowa analiza heteroplazmy mitochondrialnego DNA w ludzkich pojedynczych oocytach, blastoidach i pluripotencjalnych komórkach macierzystych” Chongwei Bi, Lin Wang, Yong Fan, Baolei Yuan, Samhan Alsolami, Yingzi Zhang, Pu-Yao Zhang, Yanyi Huang, Yang Yu, Juan Carlos Izpisua Belmonte i Mo Li, 4 kwietnia 2023 r., Badania kwasów nukleinowych.
   DOI: 10.1093/nar/gkad209
2. „Sekwencjonowanie mtDNA pełnej długości pojedynczej komórki przez iMiGseq odkrywa nieoczekiwane zmiany heteroplazmy w edycji mtDNA” autorstwa Chongwei Bi, Lin Wang, Yong Fan, Baolei Yuan, Gerardo Ramos-Mandujano, Yingzi Zhang, Samhan Alsolami, Xuan Zhou, Jincheng Wang, Yanjiao Shao, Pradeep Reddy, Pu-Yao Zhang, Yanyi Huang, Yang Yu, Juan Carlos Izpisua Belmonte i Mo Li, 31 marca 2023 r., Badania kwasów nukleinowych.
   DOI: 10.1093/nar/gkad208