W niedawnym badaniu opublikowanym na serwerze bioRxiv*preprint opisano szybką mutagenezę i ratowanie wariantów koronawirusa 2 zespołu ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2) bez klonowania, przy użyciu nowatorskiej strategii odwrotnej genetyki.

Badanie: Szybka, wolna od klonowania mutageneza nowych wariantów SARS-CoV-2 przy użyciu nowatorskiej platformy genetyki odwrotnej. Źródło obrazu: kentoh/Shutterstock.com

*Ważna uwaga: bioRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie są recenzowane i dlatego nie powinny być traktowane jako rozstrzygające, kierujące praktyką kliniczną/zachowaniami zdrowotnymi ani traktowane jako ustalona informacja.

Tło

Ustalone metody genetyki odwrotnej dla CoV zostały dostosowane do SARS-CoV-2 po jego pojawieniu się. Metoda oparta na DNA, zakaźne amplikony subgenomowe (ISA), umożliwia rekombinację transfekowanych nakładających się fragmentów DNA w genom pełnej długości, który został niedawno dostosowany do SARS-CoV-2.

Badanie i ustalenia

W niniejszym badaniu naukowcy opracowali i opisali strategię opartą na ISA, zwaną „wolnym od klonowania i wymiennym systemem do inżynierii i ratowania wirusów” (CLEVER), wykorzystującą SARS-CoV-2.

Osiem nakładających się fragmentów genomowych SARS-CoV-2 zamplifikowano i transfekowano do komórek HEK293T. Otrzymaną propagację rekombinowanego wirusa (rCOV2) oceniono obserwując efekt cytopatyczny (CPE).

Zespół zaobserwował pierwszy CPE pięć do ośmiu dni po transfekcji (DPT). Nie zaobserwowali żadnej poprawy w odzyskiwaniu wirusa przy kotransfekcji plazmidu eksprymującego nukleotydy lub informacyjnego RNA (mRNA). Ponadto, w ramach optymalizacji, fragmenty zostały zmniejszone z ośmiu do czterech.

Zaobserwowano jedną komórkę wytwarzającą wirusa na 11 000 komórek przez transfekcję czterech fragmentów, w porównaniu z jedną na 160 000 komórek w przypadku transfekcji ośmioma fragmentami.

Ponadto zespół przetestował wpływ transfekcji przy użyciu czterech fragmentów na wierność odtwarzania, porównując zdolność replikacji izolatów typu dzikiego i wirusów rekombinowanych. Rozmiar i kształt wirusa typu dzikiego i rCOV2 wygenerowanego z czterech fragmentów (rCOV2-4fr) były podobne.

Chociaż kinetyka replikacji rCOV2-4fr ujawniła obniżone miana w ciągu 24 godzin po zakażeniu, miana były porównywalne po przedłużonej infekcji. Do porównania integralności wirionów zastosowano transmisyjną mikroskopię elektronową. rCOV2-4fr był nie do odróżnienia od wirusa typu dzikiego.

Zespół wskazał, że proces odtwarzania był powtarzalny, z pomyślnym odzyskaniem wirusa z linii komórkowych HEK293, HEK293T, BHK-21 i CHO.

Następnie zespół zoptymalizował proces amplifikacji, przyjmując pewne zasady, takie jak użycie wysokiej jakości matrycy lub polimerazy o wysokiej wierności, ograniczenie cykli amplifikacji do 25 i połączenie ośmiu równoległych reakcji amplifikacji.

Naukowcy wprowadzili miejsce markera genetycznego (rozpoznawanie Sal I) w celu odróżnienia rekombinowanych wirusów od przypadkowego zanieczyszczenia izolatami klinicznymi. Marker ten był obecny we wszystkich rekonstytuowanych wirusach.

Co więcej, zespół wprowadził sekwencję genu kolca wariantów SARS-CoV-2, zachowując jednocześnie pozostałą sekwencję szczepu przodków (Wuhan) jako tło.

Sekwencja docelowa (wariant genu wypustki) została zamplifikowana przy użyciu komercyjnych lub własnych plazmidów. Chimeryczne cząsteczki wirusowe zostały uratowane i potwierdzone przez sekwencjonowanie.

Uratowane wirusy chimeryczne lub izolaty kliniczne szczepu Wuhan i wariantów Omicron BA.1 lub BA.5 poddano próbkom surowicy od zaszczepionych osób. Najwyższe miana neutralizacji były skierowane przeciwko szczepowi Wuhan. Miana były podobne między chimerycznymi wirusami i ich odpowiednimi homologami kolców.

Etap amplifikacji można wykorzystać do mutagenezy bez od nowa synteza lub klonowanie. Zespół zaprojektował parę oligonukleotydów, która wprowadziła N501Y lub G614D. Fragmenty niosące te mutacje punktowe kotransfekowano z innymi fragmentami wymaganymi do złożenia genomu.

Sekwencjonowanie potwierdziło pomyślne wprowadzenie podstawień. Ponadto zaprojektowali startery oligonukleotydowe do usuwania ORF3a, co zostało potwierdzone przez sekwencjonowanie i immunoblot.

Poza tym zespół z powodzeniem wprowadził specyficzną dla miejsca sekwencję obcą (potrójny znacznik FLAG) w pobliżu karboksylowego końca ORF8. Ponadto naukowcy nieznacznie zmodyfikowali strategię bezpośredniego ratowania rCOV2 z izolatów klinicznych.

Sklonowali eukariotyczne elementy ekspresyjne wymagane do zależnej od DNA transkrypcji genomu wirusowego lub uzyskali komercyjnie niestandardowe plazmidy kodujące te elementy. Wszystkie elementy połączono w pojedynczy łącznik DNA.

Sto par zasad wirusowych regionów nieulegających translacji 3′ i 5′ (UTR) otaczało fragment łącznika po obu stronach. Został zaprojektowany do udanej rekombinacji w kolisty produkt DNA. Osiem fragmentów genomowych SARS-CoV-2 zamplifikowano w jednym etapie z wirusowego RNA. Amplikony kotransfekowano fragmentem łącznikowym. Żywotne wirusy zostały uratowane na siedmiu DPT.

Pozwoliło to na uratowanie różnych wirusów chimerycznych bez klonowania bakterii. Zamplifikowano genomy izolatów klinicznych szczepu SARS-CoV-2 Wuhan i wariantów Omicron (BA.1 i BA.5).

Fragment zawierający gen wypustki wymieniono z odpowiednimi fragmentami niosącymi warianty genu wypustki. W rezultacie wygenerowano chimeryczne wirusy niosące heterologiczne geny wypustek.

Ostatecznie zespół uratował rekombinowanego wirusa z klinicznego izolatu Omicron BA.5, jak opisano wcześniej, ale ze starterami wprowadzającymi delecję ORF3a. Podobnie uratowano rekombinowany XBB.1.5 z delecją ORF3a. W ten sposób autorzy mogli wygenerować mutanty delecyjne pojawiających się wariantów SARS-CoV-2 w jednym kroku.

Wnioski

Podsumowując, podejście CLEVER było bardzo wszechstronne i miało szerokie zastosowanie w szybkiej mutagenezie lub ratowaniu SARS-CoV-2 bez klonowania. Autorzy wykazali elastyczność tej techniki, wprowadzając mutacje punktowe, obce sekwencje lub delecję ORF3a.

Ponadto, poprzez wewnątrzkomórkową cyrkulację przy użyciu fragmentu łącznika, wprowadzili delecję ORF3a i uratowali funkcjonalne rekombinowane wirusy w jednym etapie z wirusowego RNA.

*Ważna uwaga: bioRxiv publikuje wstępne raporty naukowe, które nie są recenzowane i dlatego nie powinny być traktowane jako rozstrzygające, kierujące praktyką kliniczną/zachowaniami zdrowotnymi ani traktowane jako ustalona informacja.