Zespół badaczy pod przewodnictwem profesora Sebastiana Deindla z Uniwersytetu w Uppsali opracował pionierską metodę, która znacznie poprawia zdolność obserwacji i analizy złożonych procesów biologicznych na poziomie pojedynczej cząsteczki. Ich praca ma zostać opublikowany w kolejnym numerze czasopisma Nauka.

„Dzięki naszej nowej technice możemy teraz rozszerzyć biofizykę pojedynczych cząsteczek na skalę genomu. Oczekuje się, że ten postęp znacznie pogłębi naszą wiedzę na temat tego, jak białka wchodzące w interakcje z kwasami nukleinowymi funkcjonują zarówno w zdrowiu, jak i w chorobie” – mówi profesor Sebastian Deindl, starszy autor badania.

Metoda, która nazywa się MUSCLE (Multipleksowana charakterystyka pojedynczej cząsteczki w skali bibliotecznej), otwiera drzwi do dokładniejszych i bardziej kompleksowych badań systemów biologicznych, gdzie zrozumienie pełnego spektrum zachowań molekularnych jest kluczowe. Oczekuje się, że będzie miało głęboki wpływ na badanie złożonej dynamiki molekularnej jako funkcji sekwencji lub przestrzeni chemicznej, umożliwiając badaczom eksplorację wcześniej nieznanych terytoriów w biologii.

Nowo opracowana metoda pokonuje znaczące ograniczenie w dziedzinie mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek, które do tej pory było ograniczone niską przepustowością ze względu na pracochłonną naturę analizowania jednej próbki na raz. Tradycyjne podejścia ograniczały się do badania niewielkiej liczby reprezentatywnych próbek, co mogło prowadzić do błędów i utraconych okazji do odkrywania nowych spostrzeżeń w dużych bibliotekach cząsteczek.

MUSCLE rozwiązuje to wyzwanie, łącząc mechanistyczne spostrzeżenia z mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek z możliwościami sekwencjonowania nowej generacji o wysokiej przepustowości. Przepływ pracy rozpoczyna się od przymocowania biblioteki fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek do powierzchni znanej jako komora przepływowa Illumina MiSeq. Komora przepływowa jest następnie umieszczana na mikroskopie fluorescencyjnym pojedynczych cząsteczek za pomocą adaptera wydrukowanego w technologii 3D, co pozwala badaczom obserwować dynamikę poszczególnych cząsteczek w czasie rzeczywistym w wielu polach widzenia. Po obrazowaniu komora przepływowa jest poddawana standardowemu sekwencjonowaniu Illumina, które generuje klastry identycznych kopii wcześniej zaobserwowanych cząsteczek. Następnie klastry te są dopasowywane do odpowiadających im cząsteczek na podstawie ich położenia w komorze przepływowej.

„Rejestracja przestrzenna danych z obrazowania pojedynczych cząsteczek i sekwencjonowania Illumina okazała się niezwykle trudna, ale problem został już rozwiązany” – mówi dr Anton Sabantsev, współautor pierwszego badania.

To innowacyjne podejście pozwala badaczom na jednoczesne profilowanie dynamiki ogromnej liczby próbek, zapewniając tym samym pełniejsze zrozumienie złożonych procesów biologicznych.

„Nasza metoda umożliwia bezpośrednią obserwację dynamicznych zachowań molekularnych w rozległych bibliotekach, znacznie zwiększając naszą zdolność do odkrywania ogólnych trendów, zachowań odstających od normy i unikalnych dynamicznych sygnatur, które w przeciwnym razie pozostałyby ukryte. Jest gotowa zmienić sposób, w jaki badamy skomplikowaną dynamikę biocząsteczek, z szerokim zastosowaniem w biologii molekularnej, genetyce i odkrywaniu leków” — mówi profesor Deindl.

Pierwsi współautorzy badania, dr Javier Aguirre Rivera, dr Guanzhong Mao, dr Anton Sabantsev i M. Panfilov, wnieśli znaczący wkład w rozwój i walidację tej nowej techniki.

„Kluczem do tego bardzo trudnego, wieloletniego wysiłku była wspaniała praca zespołowa naszych członków. Każdy wniósł coś innego, co było kluczowe dla przezwyciężenia przeszkód technicznych, z którymi się zmierzyliśmy” – mówi dr Guanzhong Mao.

W skład zespołu badawczego wchodził również Magnus Lindell z SciLifeLab National Genomics Infrastructure w Uppsali, którego wiedza specjalistyczna odegrała kluczową rolę w integracji sekwencjonowania nowej generacji z przepływem pracy MUSCLE. W swoich początkowych eksperymentach zespół zastosował tę metodę do profilowania dynamiki spinki do włosów DNA i odwijania/odwijania DNA indukowanego przez Cas9. Ich odkrycia ujawniły nieoczekiwane zachowania w niektórych sekwencjach docelowych, podkreślając potencjał tej metody do odkrywania nowych spostrzeżeń biologicznych.

Biorąc pod uwagę jej zależność od powszechnie dostępnej mikroskopii fluorescencyjnej i instrumentów MiSeq, a także łatwość wykonania niezbędnego adaptera za pomocą druku 3D, metoda ta jest wysoce dostępna dla szerszej społeczności naukowej. Może być dostosowana do badania szerokiej gamy białek oddziałujących z kwasami nukleinowymi, a także białek, związków lub ligandów kodowanych kreskowo DNA.