Opiekunowie osób dotkniętych chorobą podpisali formularz świadomej zgody na udział w badaniu. Izraelski Najwyższy Komitet Helsiński zatwierdził badanie; (GMC-991110, NHR-58-17).

Kobieta w ciąży nr 1 (V6, Ryc. 1A), 22-letnia, zdrowa i w związku małżeńskim (kuzyni pierwszego stopnia w linii prostej), która w trzeciej ciąży (VI13, Ryc. 1A) zgłosiła się na badanie neurosonograficzne płodu, ponieważ wcześniejsze badanie USG płodu w 23 + 1 tygodniu ciąży (WG) wykazało małogłowie i hipoplazję ciała modzelowatego (CC). Później, w 19. tygodniu czwartej ciąży (VI14, Ryc. 1A), zgłosiła się z podobnymi nieprawidłowościami mózgu płodu w anatomii płodu. W piątej ciąży miała badanie CVS w 11 WG.

A Rodowód rozszerzonej rodziny muzułmańskiej przedstawiający nową patogenną odmianę genetyczną TAF8. B Wyrównanie sekwencji splicingowej w TAF8 ortologi wykazują wysoki stopień zachowania wariantu c.45 + 5 G > A (zaznaczonego na żółto) i prawie całkowite zachowanie pobliskich pozostałości (zaznaczonego na jasnoniebiesko). C Schematyczna reprezentacja TAF8 gen (słupki = eksony) i wcześniej zgłoszone warianty patogenne, w tym nowy wariant c.45 + 5 G > A, opisany tutaj po raz pierwszy.

Kobieta ciężarna nr 2 (V8, ryc. 1A), 24-latka w pierwszej ciąży z małżeństwa spokrewnionego (kuzyni pierwszego stopnia), zgłosiła się do nas po badaniu USG płodu wykonanym w 23 tygodniu i 2 dniu, które wykazało krótki CC, hipoplazję móżdżku i małogłowie (VI15, ryc. 1A).

Kobieta w ciąży nr 3 (VI5, ryc. 1A), 22-latka w pierwszej ciąży z małżeństwa spokrewnionego (kuzyni pierwszego i drugiego stopnia), zgłosiła się w 23 WG na badanie anatomii płodu, które wykazało opóźniony wzrost płodu (odpowiednik 19–20 tygodnia), małogłowie i poważny zanik mózgu (VII1, ryc. 1A). Wcześniejsze badanie płodu w 15 WG wykazało obustronne torbiele szyjki macicy bez dodatkowych nieprawidłowych wyników. Wszystkie trzy kobiety są spokrewnione (ryc. 1A).

Badania obrazowe

Badania ultrasonograficzne

Badania neurosonograficzne płodu wykonywano przy użyciu aparatu GE Voluson E10, a ocenę ośrodkowego układu nerwowego płodu wykonywano w projekcjach osiowej, strzałkowej i czołowej, wykorzystując zarówno podejście brzuszne, jak i przezpochwowe.

MRI mózgu

Kobiety w ciąży nr 1 (V6, ryc. 1A) i nr 2 (V8, ryc. 1A) przeszły badanie MRI mózgu płodu (skaner MRI 3T Siemens Skyra lub skaner Discovery MR 450 firmy GE) odpowiednio w 28 i 29 WG. Po sekwencji echa gradientowego lokalizującego wykonano obrazy ultra T2-ważonego pojedynczego ujęcia szybkiego echa spinowego MR w płaszczyznach osiowej, czołowej i strzałkowej.

U kobiety ciężarnej nr 3 (VI5, ryc. 1A) ciążę przerwano w 20 tygodniu ciąży. Bezpośrednio po zabiegu wykonano pośmiertne badanie MRI przy użyciu 1,5T (GE, OPTIMA 450 W), sekwencji T1- i T2-zależnych, FSE, 3D cube, SWI, DWI.

Analiza patologiczna

Płód żeński (VI14 Ryc. 1A) z parametrami wzrostu zgodnymi z 20 WG przywieziono na badania PM płodu obejmujące całe ciało i mózg, stosując standardowy protokół [11].

Hodowla komórkowa

Aby zbadać wpływ wariantu genetycznego na TAF8 w odniesieniu do ekspresji RNA i białka, pierwotne hodowle komórek fibroblastów uzyskano z biopsji skóry pobranych od płodu z niedoborem TAF8 (VI14 Ryc. 1A) i dwóch normalnych kontrolnych fibroblastów od zdrowych dawców (nie płodów) przy użyciu standardowych protokołów. Fibroblasty wybrano, ponieważ są to identyczne typy komórek bez potencjału różnicowania. Komórki fibroblastów i komórki układu nerwowego pochodzą zarówno z ektodermy.

Blotowanie Western

Białka wyekstrahowano z fibroblastów zdrowych dawców i płodu VI14, a także z zarodków myszy WT. Analizę Western blot (WB) wykonano przy użyciu pierwotnego przeciwciała TAF8, Abcam (Waltham, MA, USA; nr kat. ab204894) i przeciwciała anty-β-aktyny, Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA; nr kat. 8H10D10) w stężeniach 1:250. Drugorzędne przeciwciała eksperymentów WB obejmowały IgG-HRP Goat Anti-Rabbit, Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX USA; nr kat. SC 2004) i IgG-HRP Goat anti-Mouse, Invitrogen (Paisley, UK; nr kat. A16072) w stężeniach 1:2000. Membranę sfilmowano przy użyciu G:BOX (Syngene, Frederick, WA, USA) ze światłem chemiluminescencyjnym.

Synteza cDNA

Produkcja RNA i cDNA została przeprowadzona z komórek fibroblastów (dotkniętych VI14 i zdrowych kontroli) przy użyciu standardowego protokołu za pomocą zestawu qScript™ cDNA Synthesis Kit (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Amplikony cDNA dla TAF8 i GAPDH zostały ocenione przy użyciu analizy multipleksowej. GAPDH został użyty jako gen referencyjny i znormalizowany do zdrowych kontroli.

Sekwencjonowanie Sangera

Sekwencjonowanie Sangera wykonano przy użyciu analizatora genetycznego ABI Prism 3500xl, Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). Standardowe protokoły.

Analiza statystyczna

Analiza statystyczna wliczona T-test i jednokierunkowy test ANOVA przeprowadzone przez Prism—GraphPad Software (GraphPad Software, Boston, MA, USA).