W niedawnym badaniu opublikowanym w czasopiśmie NaturaNaukowcy przedstawili strukturę molekularną transportera dopaminy (DAT) połączonego z kokainą.

Kokaina jest silnie uzależniająca, a jej niewłaściwe stosowanie może zaostrzać zaburzenia psychiczne. Chociaż wywiera ona wpływ poprzez wiązanie się z transporterami monoamin, jej hamowanie DAT leży u podstaw jej uzależniających i nagradzających właściwości. Obecnie nie ma eksperymentalnych struktur ludzkiego DAT (hDAT). Niemniej jednak spostrzeżenia z homologów, takich jak członkowie rodziny nośników rozpuszczonych 6 (SLC6) i Muszka owocowa melanogaster DAT (dDAT) dostarcza informacji strukturalnych.

Badanie: Struktura ludzkiego transportera dopaminy w kompleksie z kokainą. Źródło obrazu: Naeblys / Shutterstock

Ujawniają one wspólną architekturę 12 transbłonowych helis (TM1–TM12) w pseudosymetrycznym fałdzie (fałdzie LeuT), z miejscem wiązania substratu w rdzeniu. U wszystkich członków rodziny SLC6 do centralnego miejsca wiązania substratu można uzyskać dostęp z wewnątrzkomórkowej lub zewnątrzkomórkowej powierzchni błony, a energia do transportu substratu pochodzi z jonu sodu (Na⁺) współtransport. Podczas gdy wiele z nich zależy również od jonów chlorkowych (Cl^–), czy Cl^– pozostaje niejasne, gdzie jest wiązany/transportowany.

kl^– wiązanie w DAT może allosterycznie zmniejszyć powinowactwo drugiego miejsca sodowego (Na2). Miejsce Na2 może być konieczne do izomeryzacji transportera do stanu skierowanego do wewnątrz przed uwolnieniem substratu, który następnie przechodzi do konformacji otwartej na zewnątrz. W kompleksie dDAT-kokaina kokaina wiąże się z centralnym miejscem wiązania substratu. Jednakże dDAT ma wyższą homologię sekwencji z ludzkim transporterem noradrenaliny (hNET) niż z hDAT.

Badanie i ustalenia

W niniejszym badaniu naukowcy przeprowadzili rekonstrukcję hDAT związanego z kokainą za pomocą kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM). Najpierw komórki Expi293F zostały użyte do ekspresji hDAT oznaczonego Twin-Strep (hDAT^Bliźniak), który został oczyszczony w micelach glikodiosgeniny (GDN). Znacznik zmniejszył całkowity wychwyt dopaminy, co wskazuje, że hDAT^Bliźniak wykazywały niższą ekspresję niż hDAT dzikiego typu po przejściowej ekspresji w komórkach COS7.

Następnie struktura hDAT^Bliźniak związany z kokainą został rozwiązany przy użyciu kriomikroskopii elektronowej przy rozdzielczości 2,66 Å. Miał on konformację otwartą na zewnątrz z 12 TM tworzącymi fałd LeuT. TM 11 i 12 znajdowały się poza domeną rdzeniową, przy czym TM12 był prawie zagięty w połowie. Pętla zewnątrzkomórkowa 4 (EL4) utworzyła strukturę przypominającą spinkę do włosów, która częściowo zakrywała wyjście z centralnego miejsca wiązania (S1).

Ogólna struktura przypominała skierowane na zewnątrz struktury ludzkiego transportera serotoniny (hSERT) i dDAT. Naukowcy zbadali, czy procedura oczyszczania wpłynęła na ogólną strukturę. W związku z tym zmierzyli wiązanie z analogiem kokainy i nie znaleźli różnic między jego powinowactwem do hDAT, gdy był wyrażany w komórkach COS7 lub oczyszczany w micelach detergentowych.

Podobnie powinowactwo do kokainy nie różniło się znacząco. hDAT^Bliźniak został zrekonstruowany do proteoliposomów z Na⁺ mierzono gradient i zależny od czasu wychwyt dopaminy. Zmierzono wychwyt specyficzny, wskazujący, że hDAT^Bliźniak może przyjąć wszystkie stany konformacyjne niezbędne do transportu substratu, nawet po oczyszczeniu.

Kokaina hamowała aktywność transportu przy stałej inhibicji podobnej do tej w komórkach COS7. Cząsteczka kokainy znajdowała się w hDAT^Bliźniak rdzeń w odległości oddziaływania reszt S1. Miejsce S1 ma trzy podmiejsca (A – C). Trzeciorzędowa amina w pierścieniu tropanowym kokainy utworzyła interakcję jonową z Asp79 w podmiejscu A. Ponadto kokaina zaangażowała podmiejsce B poprzez swój pierścień benzenowy, tworząc interakcję π–π krawędź-do-ściany z Tyr156.

Trzy cząsteczki wody utworzyły wiązania wodorowe wokół pierścienia benzenowego, z których dwa są nieobecne w strukturze dDAT. Ponadto, zajęte były tylko miejsca chlorkowe i Na2, podczas gdy pierwsze miejsce sodowe (Na1) zostało albo zapadnięte, albo nigdy nie powstało w wiązaniu kokainy. Różnica między hDAT^Bliźniak -kompleksy kokainy i świńskiego SERT (pSERT)- i dDAT-kokainy stanowiły pozycję EL4.

W kompleksach pSERT i dDAT pętla zajmowała podobną pozycję, ale w kompleksie hDAT^Bliźniak kompleks, został przesunięty o 3,7 Å od TM1b wraz z przesunięciem o 2,2 Å Trp84 Cα. Co więcej, płaszcz gęstości niebiałkowych został zaobserwowany na granicy między micelą GDN i hDAT^Bliźniak-kompleks kokainy, który nie został zgłoszony w przypadku rekonstrukcji kriomikroskopii elektronowej transportera monoamin. Gęstości te były niejednorodne i występowały głównie na obrzeżach hDAT^Bliźniak.

Cztery z tych gęstości były porównywalne pod względem wielkości i kształtu; trzy znajdowały się w uprzednio zgłoszonych miejscach cholesterolu (CHOL1, CHOL2 i CHOL3), a jedna (CHOL4) znajdowała się poniżej CHOL3. Naukowcy dopasowali cząsteczkę półbursztynianu cholesterolu w CHOL2 i cząsteczkę cholesterolu w gęstości w CHOL3. Ponadto model cholesterolu dopasowano do gęstości w CHOL4. Symulacje dynamiki molekularnej wskazały, że hNET zawiera analog CHOL4.

Wnioski

Wspólnie badacze rozwiązali strukturę kriomikroskopii elektronowej kompleksu hDAT-kokaina przy 2,66 Å. Struktura była konformacją otwartą na zewnątrz z jednym Na⁺ obecny w miejscu Na2 i o gęstości odpowiadającej Cl^– wykryto w miejscu chlorkowym. Co znamienne, strukturę rozwiązano bez użycia molekularnych punktów odniesienia, które są często stosowane w kriomikroskopii elektronowej małych białek błonowych. Odkrycia te pogłębiają zrozumienie pobudzających i uzależniających właściwości kokainy i mogą pomóc w opracowaniu ukierunkowanych leków na uzależnienie.