Nowa technika opracowana w Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) znacznie ułatwi naukowcom odkrywanie cech lub aktywności kodowanych przez geny o nieznanej funkcji u mikrobów, co stanowi kluczowy krok w kierunku zrozumienia roli i wpływu poszczególnych gatunków.

Podejście to, zwane sekwencjonowaniem biblioteki bakteryjnej typu shotgun z nadmierną ekspresją kodów kreskowych, czyli Boba-seq, opisano w artykule opublikowano 5 sierpnia w Komunikacja przyrodnicza.

„Jest tak wiele ciemnej materii genetycznej – DNA, którą możemy szybko sekwencjonować za pomocą dzisiejszych metod, ale nie znamy jej funkcji – w mikrobiologicznym wszechświecie. I pytanie brzmi, jak kiedykolwiek będziemy badać całą tę materię, aby zrozumieć mikrobiomy wokół nas? Podstawowa odpowiedź brzmi – tak jak to” – powiedział główny autor Adam Arkin, starszy naukowiec wydziału w Berkeley Lab’s Biosciences Area.

Boba-seq polega na pobieraniu losowych fragmentów DNA z interesujących bakterii i wyrażaniu ich w komórkach bakteryjnych gospodarza. „Pomysł polega na tym, że możemy zobaczyć, jak obecność nowych genów nadaje różnicę w fenotypie wzrostu tej bakterii” — powiedziała pierwsza autorka Yolanda Huang, adiunkt mikrobiologii i immunologii na University of Buffalo, która była badaczką podoktorską w laboratorium Arkina w czasie badania. „To podejście genomiki funkcjonalnej, którego możemy użyć, aby szybko połączyć gen lub fragment sekwencji DNA z potencjalną funkcją”.

Termin „kod kreskowy” w nazwie odnosi się do małej sekwencji DNA, której naukowcy używają jako znacznika identyfikacyjnego dla znacznie większego fragmentu DNA, podobnie jak kod kreskowy w sklepie spożywczym identyfikuje konkretny przedmiot za pomocą małego kodu. Cały genom badanego organizmu jest losowo rozdzielany na fragmenty zawierające pojedyncze geny lub klastry kilku genów, a następnie wprowadzany do plazmidów – kolistych pakietów DNA – które zostały oznaczone unikalnymi kodami kreskowymi. „Biblioteka” Boba-seq odnosi się do wszystkich kodowanych kreskowo plazmidów zawierających fragmenty organizmu. Tę bibliotekę można wprowadzić do różnych gospodarzy bakteryjnych w celu wygenerowania ogromnej liczby wariantów genetycznych, które następnie są przeszukiwane pod kątem nowych zachowań lub właściwości.

Arkin i jego współpracownicy z obszaru nauk biologicznych to czołowi eksperci w dziedzinie technik wysokoprzepustowych służących do badania funkcji genów. Uczestniczyli także w opracowaniu szeregu innych technik, które albo wprowadzają, albo wyciszają geny w celu zbadania ich funkcji, w tym RB-TnSeq, CRISPRi i Dub-Sekwencja.

Dzięki Boba-seq setki tysięcy fragmentów z kodem kreskowym można umieścić w komórkach gospodarza i hodować w różnych warunkach, aby określić funkcję w jednym eksperymencie. Na przykład, jeśli komórki z pewnym kodem kreskowym rosną szczęśliwie, gdy cała hodowla jest wystawiona na działanie antybiotyku, ale inne giną, wiesz, że gen lub geny w tym fragmencie kodowały cechy oporności na antybiotyki. A identyfikacja fragmentu odpowiedzialnego za tę nową zdolność jest tania i szybka dzięki kodowi kreskowemu.

„Innowacje Yolandy w Boba-seq pozwalają nam zidentyfikować, które z setek tysięcy fragmentów nadają fenotyp lub właściwość, których chcemy” — powiedział Arkin. „Nasza nowa strategia pozwala nam tworzyć biblioteki i używać ich z większą przepustowością niż poprzednie podejścia do nadmiernej ekspresji”.

Innym znaczącym przełomem jest to, że fragmenty Boba-seq można testować w tym samym organizmie, z którego zostały pobrane (lub u bliskiego krewnego), co jest niezbędne do uzyskania dokładnego obrazu tego, co robi gen. Poprzednie techniki są ograniczone, ponieważ testują one tylko geny wewnątrz organizmów modelowych, takich jak Pałeczka okrężnicy i drożdży. Geny z organizmów bardzo różnych od Pałeczka okrężnicy często nie są funkcjonalne pałeczka okrężnicy co utrudnia lub uniemożliwia uzyskanie wyraźnego obrazu tego, co robią geny.

Narzędzie obliczeniowe używane do przetwarzania wyników z prac laboratoryjnych związanych z Boba-seq jest dostępne dla innych badaczy na platformie open source. „Jestem podekscytowana tym, jak inni mogą używać Boba-seq na całym świecie, zwłaszcza w badaniach metagenomicznych jelit lub środowiska” — powiedziała współautorka Allison Hung, studentka studiów podyplomowych na UC Berkeley w laboratorium Arkin. „Możliwość wyodrębnienia informacji funkcjonalnych ze społeczności mikrobów bez izolacji oszczędza ogromną ilość czasu i zasobów i będzie kluczowa dla badania mikrobów, które trudno hodować w laboratorium, takich jak te żyjące w złożonych ekosystemach obecnie badanych w ramach projektu ENIGMA”. ENIGMA, skrót od Ecosystems and Networks Integrated with Genes and Molecular Assemblies, to obszar zainteresowań naukowych Departamentu Energii (DOE) współprowadzony przez Arkin, którego celem jest zrozumienie, w jaki sposób społeczności mikrobów krążą w ekosystemach i detoksykują toksyczne zanieczyszczenia metalami ciężkimi.

Po zbudowaniu i udoskonaleniu Boba-seq zespół Arkina przetestował nową technikę, badając geny w Bacteroidales, taksonomicznym rzędzie mikrobów, które są liczne w ludzkich jelitach i o których wiadomo, że odgrywają wiele ról w naszym wewnętrznym mikrobiomie. Bacteroidales odgrywają również ważną rolę w procesach glebowych, gdzie rozkładają materię organiczną i zwracają składniki odżywcze roślinom. Zespół wygenerował 305 000 kodowanych kreskowo fragmentów z bibliotek sześciu gatunków Bacteroidales i równolegle ocenił ponad 21 000 genów kodujących białka.

Wyniki tych eksperymentów dowodzących słuszności zasady ujawniły, że geny kodujące enzymy, które budują pewne cząsteczki lipidowe, nadają oporność na ceftriakson, antybiotyk z klasy cefalosporyn. Geny te nie były wcześniej powiązane z opornością na antybiotyki i wymagają dalszych badań.

Zespół odkrył również kilka nowych funkcji w metabolizmie węglowodanów, w tym enzym potrzebny do metabolizowania glukozaminy, zmodyfikowanej cząsteczki cukru występującej w kościach, tkance łącznej i pancerzach owadów i skorupiaków. W jelitach mikroby wykorzystują glukozaminę jako cząsteczkę energetyczną i do budowy ścian komórkowych, podczas gdy ludzkie komórki tworzące wyściółkę jelita wykorzystują ją do produkcji błony śluzowej, która pomaga utrzymać zdrowe wchłanianie składników odżywczych i zapobiega inwazji patogenów.

Te spostrzeżenia na temat bakterii Bacteroidales pomogą badaczom zdrowia lepiej zrozumieć funkcjonowanie jelit, ponieważ rząd ten działa jako „komensale przez większość czasu i naprawdę utrzymuje zdrowie jelit” — powiedział Huang. „Jednak w niektórych stanach składniki odżywcze uwalniane przez bakterie Bacteroidales mogą być wykorzystywane przez patogeny do wspierania ich własnego wzrostu”.

Arkin i jego koledzy z ENIGMA używają teraz Boba-seq do badania, w jaki sposób mikroby glebowe czerpią energię ze złożonych cząsteczek opartych na węglu w środowisku, których większość form życia nie jest w stanie zmetabolizować. Tymczasem Huang planuje użyć Boba-seq w swoim nowym laboratorium w Jacobs School of Medicine & Biomedical Sciences na Uniwersytecie w Buffalo, aby zbadać geny, których bakterie używają do unikania ataków bakteriofagów (wirusów, które infekują bakterie), zwiększenia wydajności kolonizacji w jelitach i rozkładania złożonych węglowodanów.

Badania te były częściowo wspierane przez DOE Office of Science. Yolanda Huang jest laureatką nagrody Astellas Pharmaceuticals Awardee przyznawanej przez Life Sciences Research Foundation.

###

Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) zobowiązuje się do dostarczania rozwiązań dla ludzkości poprzez badania nad czystą energią, zdrową planetą i nauką odkrywczą. Założone w 1931 r. w oparciu o przekonanie, że największe problemy najlepiej rozwiązują zespoły, Berkeley Lab i jego naukowcy zostali wyróżnieni 16 Nagrodami Nobla. Naukowcy z całego świata polegają na światowej klasy naukowych obiektach Laboratorium w zakresie własnych pionierskich badań. Berkeley Lab to wieloprogramowe laboratorium krajowe zarządzane przez University of California dla Biura Nauki Departamentu Energii USA.

Biuro Nauki DOE jest największym pojedynczym sponsorem badań podstawowych w naukach fizycznych w Stanach Zjednoczonych i pracuje nad rozwiązaniem niektórych z najbardziej palących wyzwań naszych czasów. Aby uzyskać więcej informacji, odwiedź stronę energia.gov/nauka.