Wirusy RNA, takie jak koronawirus, który powoduje COVID-19, biorą udział w wyścigu życia i śmierci w momencie, gdy zakażą komórkę.

Wirusy te mają tylko kilka minut, aby ustanowić swoją maszynerię replikacji w komórce gospodarza, zanim instrukcje genetyczne zawarte w ich wrażliwych genomach RNA – które są bardziej kruche niż DNA – zostałyby w przeciwnym razie zniszczone przez utrzymanie porządku komórkowego. Jeśli się powiedzie, wirus może przejść od zaledwie kilku kopii swojego genomu RNA do pół miliona kopii włączonych do nowych cząstek zakaźnych w mniej niż 12 godzin. Jeśli nie, wirus umiera.

W badaniu opublikowanym online 24 stycznia przez Materiały Narodowej Akademii Nauk (PNAS), naukowcy z Morgridge Institute for Research rzucili nowe światło na te kluczowe wczesne etapy infekcji wirusowej i ich kontrolę. Naukowcy opracowali nowe sposoby uwalniania wirusowych kompleksów replikacyjnych RNA z komórek i wizualizacji ich w wyrafinowany sposób za pomocą krio-mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Cryo-EM łączy wysoce zaawansowane obrazowanie z rozległą analizą obliczeniową, aby umożliwić naukowcom wizualizację szybko zamrożonych cząsteczek w ich stanie natywnym z rozdzielczością molekularną do atomowej, dając rewolucyjny wgląd w strukturę biologiczną, co może stanowić potężną podstawę do opracowywania środków terapeutycznych zapobiegających chorobom.

Zespołem badawczym kieruje Paul Ahlquist, dyrektor John and Jeanne Rowe Center for Virology Instytutu oraz profesor wirusologii molekularnej i onkologii Uniwersytetu Wisconsin-Madison. W skład zespołu wchodzą naukowcy Hong Zhan, Nuruddin Unchwaniwala i Johan den Boon, badacz Morgridge i adiunkt biochemii UW-Madison Tim Grant oraz współautorzy: Andrea Rebolledo-Viveros, Janice Pennington, Mark Horswill, Roma Broadberry i Jonathan Myers.

Większość genów drobnoustrojów i gospodarzy funkcjonuje w dużych kompleksach białkowych, które działają jak maszyny molekularne. Struktury tych krytycznych zespołów były jednak w dużej mierze nieznane, co znacznie ogranicza zrozumienie i kontrolę odpowiednich procesów. W 2017 roku, używając zaawansowanego modelu wirusa, laboratorium Ahlquist dostarczyło pierwsze pełne obrazowanie wirusowego kompleksu replikacyjnego RNA i jego uderzającej organizacji.

Znaleźli „chromosom” genomowego RNA rodzicielskiego wirusa ciasno zwinięty wewnątrz pęcherzyka błony ochronnej, którego szyjkowy kanał prowadzący do cytoplazmy okazał się miejscem rzeczywistej maszynerii replikacji wirusowego RNA – dynamicznego, wielofunkcyjnego silnika kopiowania genomu – we wcześniejszym badaniu. nieznany, 12-krotnie symetryczny kompleks z pierścieniami, który nazwali „koroną”.

Teraz w swoim nowym artykule w PNAS, zespół przedstawia kolejny skok, ujawniając skomplikowaną strukturę tej korony molekularnej i jej składowych domen enzymatycznych w rozdzielczości atomowej do prawie atomowej. Te wyniki w znacznie wyższej rozdzielczości pokazują, w jaki sposób ułożonych jest wiele różnych modułów funkcjonalnych tego silnika replikacyjnego, zapewniając niezbędną podstawę do opracowania jego montażu, jego dynamicznego działania i sposobów ingerencji w oba.

Dla porównania, pierwszy autor, Hong Zhan, mówi: „Pierwsze wizualizacje maszynerii koronnej wykonane przez nasze laboratorium w 2017 roku były jak identyfikacja istnienia i ogólny zarys budynku. Nowa rozdzielczość 2023 jest jak pokazanie drobnych szczegółów, takich jak okablowanie elektryczne i kłódki.”

„W wirusologii”, mówi Ahlquist, „kompleksami, na których ludzie koncentrowali się do tej pory, były głównie cząstki zakaźne, które poruszają się między komórkami, które są stosunkowo łatwe do oczyszczenia i zbadania, ponieważ uwalniają się z komórek”.

„Jednak większość procesów replikacji wirusów zachodzi w złożonym środowisku wewnątrz komórek” – dodaje. „To nowy rozdział, w którym udało nam się dotrzeć do wnętrza komórek, aby uchwycić i zobrazować bardzo szczegółowo jeszcze bardziej skomplikowaną maszynerię wirusową, która przeprowadza centralne zdarzenia związane z replikacją wirusa”.

Członek zespołu, Johan den Boon, zauważa między innymi, że „korona składa się z dwóch ułożonych w stos 12-merowych pierścieni ogromnego wirusowego białka replikacyjnego RNA, którego wiele domen zapewnia wszystkie funkcje wymagane do syntezy nowych kopii wirusowego genomowego RNA Jednak białka w górnym i dolnym pierścieniu mają radykalnie różne konformacje, a ich domeny składowe znajdują się w różnych pozycjach względem siebie”.

Jedną z implikacji jest to, że te same domeny białkowe działają w różny sposób w górnym i dolnym pierścieniu. Wiele innych cech podkreśla, że ​​korona nie jest strukturą statyczną, ale wyrafinowaną, aktywną maszyną, która postępuje i cyklicznie wykonuje serię ruchów, aby wykonywać kolejne czynności. W oparciu o tę strukturę i dalsze ukierunkowane eksperymenty zespół Morgridge wyjaśnia funkcje korony i gimnastykę konformacyjną.

Innym cennym odkryciem z tych badań jest to, że dolny 12-merowy pierścień jest prekursorem składania, który tworzy się przed faktycznymi etapami replikacji RNA. Ten prekursor „proto-korony” rekrutuje następnie wirusową matrycę genomowego RNA i inne składniki, aby zainicjować syntezę nowych RNA i służy jako baza do złożenia dojrzałego kompleksu replikacyjnego podwójnego pierścienia.

Coraz więcej dowodów sugeruje, że korona nie tylko syntetyzuje nowe kopie wirusowego genomu RNA, ale także pomaga dostarczać te nowe genomy do dalszych procesów ekspresji genów i składania nowych zakaźnych cząstek wirusowych. Wydaje się zatem, że korona pełni główne funkcje w organizowaniu wielu krytycznych faz podczas infekcji.

„Wystarczy spowolnienie składania i funkcji kompleksów replikacyjnych RNA, aby zabić te wirusy” – mówi Ahlquist. „Te nowe wyniki stanowią solidną podstawę do znalezienia nowych sposobów, aby to zrobić”.

Ahlquist i inni członkowie zespołu chwalą UW-Madison Cryo-EM Research Center (CEMRC) i jego przywództwo jako kluczowe dla ich postępu. CEMRC udostępnia tę cenną technologię dziesiątkom naukowców z kampusu UW-Madison, a także jako centrum krajowe daleko poza nim. CEMRC, kierowany przez profesor biochemii Elizabeth Wright, zapewnia zaawansowane możliwości zasadniczo we wszystkich formach obrazowania krio-EM.

Pojawiające się wyniki grupy Morgridge i innych badaczy wskazują, że zasady ujawnione w tych badaniach są ewolucyjnie stare i że podobne kompleksy przypominające korony mają kluczowe znaczenie dla replikacji większości, jeśli nie wszystkich, wirusów RNA w tej dużej klasie. Obejmuje to koronawirusa COVID-19 SARS-CoV-2 i wiele innych patogenów.

W związku z tym zachowane podstawowe zasady mogą służyć jako podstawa do opracowania silniejszych strategii antywirusowych o szerokim spektrum działania, które mogłyby hamować infekcję nie tylko przez jedną, ale przez całe grupy wirusów, mówi Ahlquist.