Podwójna strategia edycji genów CRISPR leczy zwierzęta z HIV-1
![Podwójna strategia edycji genów CRISPR leczy zwierzęta z HIV-1](https://oen.pl/wp-content/uploads/2023/05/June23_2020_CDC_HIV-Budding-scaled-770x470.jpg)
Testy na modelach zwierzęcych przeprowadzone przez naukowców z Lewis Katz School of Medicine na Temple University i University of Nebraska Medical Center (UNMC) wykazały, w jaki sposób edytują dwa cele, HIV-1 i CCR5 – koreceptor, który pomaga wirusowi dostać się do komórek – może skutecznie wyeliminować zakażenie wirusem HIV. Zespół wykorzystał technologię opartą na CRISPR do inaktywacji CCR5 i wycięcia fragmentów DNA HIV-1 z zakażonych komórek u humanizowanych myszy (myszy hu), które również leczono długo działającymi lekami przeciwretrowirusowymi. Badacze stwierdzili, że praca ta jest pierwszą, która łączy strategię podwójnej edycji genów z lekami antyretrowirusowymi w celu wyleczenia zwierząt z HIV-1.
„Pomysł połączenia wycięcia DNA HIV-1 z inaktywacją CCR5 przy użyciu technologii edycji genów opiera się na obserwacjach zgłoszonych przypadków wyleczenia pacjentów z HIV” — wyjaśnił dr Kamel Khalili, profesor Laura H. Carnell i kierownik Katedry Mikrobiologii, Immunologii i Zapaleń, Dyrektor Centrum Neurowirusologii i Edycji Genów oraz Dyrektor Kompleksowego Centrum NeuroAIDS w Lewis Katz School of Medicine. „W nielicznych przypadkach wyleczeń HIV u ludzi pacjenci przeszli przeszczep szpiku kostnego z powodu białaczki, a użyte komórki dawcy zawierały inaktywujące mutacje CCR5”.
Dodał Howard E. Gendelman, MD, profesor i przewodniczący Wydziału Farmakologii i Neuronauki Doświadczalnej w UNMC „Wyleczenie z HIV to szerszy obraz. Dzięki naszej ciągłej współpracy Temple i UNMC przeprowadziły znaczące badania, które mogą ostatecznie wpłynąć na życie wielu ludzi”.
Sprawozdania z ich pracy w PNAS „Edycja CRISPR CCR5 i HIV-1 ułatwia eliminację wirusów u humanizowanych myszy zakażonych wirusem z supresją leków przeciwretrowialnych” – stwierdzili naukowcy. ”
Autorzy zauważyli, że obecne leczenie HIV-1 obejmuje zarówno terapię antyretrowirusową (ART), jak i szeroko stosowane przeciwciała neutralizujące. Takie zabiegi mogą zmniejszyć, ale nie wyeliminować wirusa zakaźnego. HIV integruje swoje DNA z genomem komórek gospodarza i może pozostawać uśpiony w rezerwuarach tkanek przez długi czas, poza zasięgiem leków antyretrowirusowych. W konsekwencji, gdy ART zostaje zatrzymana, replikacja HIV odnawia się, powodując AIDS. „HIV-1 ustanawia latencję w limfocytach T CD4+ i jednojądrzastych fagocytach (monocytach, makrofagach i komórkach dendrytycznych), co stanowi podstawową barierę dla wyleczenia” – zauważył zespół.
Funkcjonalne wyleczenie zakażenia HIV-1 zostało udokumentowane w trzech przypadkach, jednak w każdym przypadku leczenie ostrej białaczki szpikowej przeprowadzono za pomocą allogenicznych przeszczepów hematopoetycznych komórek macierzystych zawierających heterozygotyczne lub homozygotyczne mutacje w typie receptora chemokiny CC HIV-1 pięć genów (CCR5 Δ32). „Leczenie HIV-1 obejmowało osłabienie rozprzestrzeniania się infekcji wirusowej, obecność zakażonych wirusem komórek i rezerwuarów tkankowych oraz brak utajonego zintegrowanego prowirusowego DNA” – wyjaśnili badacze.
Biorąc pod uwagę wyniki leczenia tych pacjentów, zespół postawił hipotezę, że obecną barierę w eliminacji infekcji można pokonać za pomocą edycji genów opartej na CRISPR. Starsi badacze nowo zgłoszonego badania, Khalili i Gendelman, byli wieloletnimi współpracownikami, a we wcześniejszych pracach zespoły Khalili i Gendelman wykazały, że HIV można usunąć z genomów żywych, humanizowanych myszy zakażonych wirusem HIV, co prowadzi do leczyć u niektórych zwierząt.
W ramach tych badań Khalili i współbadacz, dr Rafał Kamiński, adiunkt w Centrum Neurowirusologii i Edycji Genów w Katz School of Medicine, połączyli swoje doświadczenie w technologii edycji genów CRISPR w celu ukierunkowania na HIV-1 ze strategią terapeutyczną znany jako długo działająca terapia przeciwretrowirusowa o powolnym i skutecznym uwalnianiu (LASER), która została opracowana wspólnie przez dr Gendelmana i Bensona Edagwę, adiunkta farmakologii w UNMC. LASER ART zatrzymuje replikację HIV na niskim poziomie przez długi czas, zmniejszając częstotliwość podawania ART.
Jednak pomimo możliwości wyeliminowania wirusa HIV u myszy LASER-ART, naukowcy odkryli, że HIV może w końcu ponownie wydostać się z rezerwuarów tkankowych i wywołać infekcję z odbicia. Efekt ten jest podobny do infekcji z odbicia u ludzi, którzy przyjmowali ART, ale nagle przerwali leczenie lub doświadczyli zakłócenia w leczeniu. Aby zapobiec ponownemu zakażeniu, Khalili i współpracownicy pracowali nad technologią CRISPR nowej generacji do wycinania wirusa HIV, opracowując nowy, podwójny system mający na celu trwałe wyeliminowanie wirusa HIV z modelu zwierzęcego. „Na podstawie historii sukcesu pacjentów z HIV, którzy przeszli przeszczep szpiku kostnego z powodu białaczki i zostali wyleczeni z HIV, nasza hipoteza była taka, że utrata receptora wirusa, CCR5, jest ważna dla trwałego wyeliminowania zakażenia HIV” – wyjaśnił Khalili.
Aby to osiągnąć, naukowcy opracowali prostą i bardziej praktyczną procedurę inaktywacji CCR5, która obejmuje inokulację dożylną cząsteczki edytującej geny CRISPR. „Zastosowanie dwóch preparatów CRISPR podawanych w sposób sekwencyjny miało na celu zablokowanie„ rozprzestrzeniania się infekcji ”obecnego na niskim poziomie podczas ART” – wyjaśnili dalej badacze. „Następnie nastąpiło usunięcie pozostałości zintegrowanego DNA HIV-1. Strategia została zaprojektowana tak, aby wpłynąć na eliminację wirusa u myszy zakażonych HIV-1”.
Eksperymenty na humanizowanych myszach LASER-ART przeprowadzone przez zespół Gendelmana wykazały, że konstrukty opracowane w Temple, podawane razem, spowodowały supresję wirusa, przywrócenie ludzkich komórek T i eliminację replikującego się HIV-1 u 58% zakażonych zwierząt. Ich odkrycia potwierdziły pogląd, że CCR5 odgrywa kluczową rolę w ułatwianiu zakażenia wirusem HIV. „Edycja genu CRISPR poprzez celowanie w CCR5 gospodarza i HIV-1 LTR-Gag przy jednoczesnym kontrolowaniu replikacji wirusa za pomocą leków przeciwretrowirusowych może prowadzić do eliminacji HIV-1 w rezerwuarach tkanek zakażonych zwierząt” – podsumował zespół. „Dowodu dostarczył brak nawrotu wirusa po 11 tygodniach od zaprzestania stosowania ART”. Naukowcy wykorzystali czułe testy PCR i wirusowe testy ratunkowe, aby potwierdzić swoje odkrycia.
Zwracając uwagę na ograniczenia swojej pracy, zespół stwierdził również: „Aby osiągnąć 100% eliminację wirusa HIV, ładunek CRISPR zawierający czynnik wycinający musi dotrzeć do wszystkich komórek i przedziałów zakażonych wirusem HIV-1 w sposób utajony”. Niemniej jednak napisali: „Podsumowując, pomimo zauważonych ograniczeń, sekwencyjne podawanie kombinacji dwóch strategii przeciwretrowirusowych za pośrednictwem CRISPR z ART osiągnęło skuteczną eliminację HIV-1 i ma potencjał do przeniesienia do kliniki… Wykazaliśmy, że dalsze ulepszenia w LASER ART i CRISPR do kombinatorycznej edycji wirusowych i strategicznie ważnych genów komórkowych, takich jak CCR5 u myszy hu, mogą osiągnąć i służyć jako dowód słuszności do dalszych badań w kierunku badań klinicznych”.
Gendelman dodał: „Jesteśmy prawdziwymi partnerami, a to, co tutaj osiągnęliśmy, jest naprawdę spektakularne. Zespół Khalili wygenerował podstawowe konstrukty do edycji genów, a następnie zastosowaliśmy te konstrukty w naszym mysim modelu LASER-ART w Nebrasce, zastanawiając się, kiedy zastosować terapię z edycją genów i przeprowadzając analizy, aby zmaksymalizować wycięcie HIV-1, inaktywację CCR5 i zahamowanie wzrostu wirusa”.
Zespół Temple przewiduje, że wkrótce może rozpocząć ocenę strategii podwójnej edycji genów u naczelnych innych niż ludzie. W tym celu Khalili będzie współpracować ze swoją współautorką Tricią H. Burdo, doktorem, profesorem i wiceprzewodniczącym w Departamencie Mikrobiologii, Immunologii i Zapaleń w Katz School of Medicine, znaną ekspertką w stosowaniu nie-ludzkich modele naczelnych do badania HIV-1. Burdo i jej zespół są zainteresowani zrozumieniem zaangażowania CCR5 u naczelnych zakażonych SIV, a laboratorium Burdo odegrało wcześniej kluczową rolę w badaniach wykazujących skuteczność i bezpieczeństwo technologii opartej na CRISPR w usuwaniu DNA HIV z komórek naczelnych.
Naukowcy są przekonani, że nowa strategia podwójnej edycji genów CRISPR jest wyjątkowo obiecująca w leczeniu HIV u ludzi. „To proste i stosunkowo niedrogie podejście” — zauważył Khalili. „Rodzaj przeszczepu szpiku kostnego, który przyniósł wyleczenie u ludzi, jest zarezerwowany dla pacjentów z białaczką. Wymaga wielu rund promieniowania i nie ma zastosowania w regionach o ograniczonych zasobach, gdzie zakażenie wirusem HIV jest najczęstsze”.