Rak jest chorobą genetyczną spowodowaną mutacjami w kodzie DNA. Badania przesiewowe mutacji nowotworowych mogą rzucić światło na ich rolę w rozwoju, progresji i odpowiedzi na leczenie nowotworu.

„Chociaż mamy dobre pojęcie o organizacji i zawartości naszego genomu, nadal nie rozumiemy, dlaczego i w jaki sposób pewne mutacje mogą prowadzić do rozwoju raka i innych chorób ludzkich o silnych powiązaniach genetycznych oraz w jaki sposób te informacje można wykorzystać w badaniach klinicznych. zastosowań” – powiedział dr Francisco Sánchez-Rivera, adiunkt biologii w Massachusetts Institute of Technology (MIT). Sieci technologiczne.

Celem badawczym Sáncheza-Rivery jest zrozumienie, w jaki sposób zmienność genetyczna kształtuje fizjologię i choroby człowieka, ze szczególnym uwzględnieniem raka. „Wiedza, które mutacje powodują choroby i dlaczego, pozostaje jednym z najważniejszych problemów, które musimy rozwiązać, aby zrozumieć i leczyć raka i inne choroby” – powiedział.

Mutacje mogą pojawić się w setkach różnych genów, a każdy gen może ulec mutacji na różne sposoby. Jest wiele tematów do omówienia, a badania przesiewowe pod kątem mutacji genetycznych nie są łatwym zadaniem. Celem Sáncheza-Rivery i współpracowników jest wykorzystanie połączenia precyzyjnej inżynierii genomu i podejść do genetyki funkcjonalnej, aby stawić czoła temu wyzwaniu.

Kontynuuj czytanie poniżej…

W Biotechnologia Przyrodyzespół badawczy wykazał użyteczność edycji pierwotnej, najnowszego rozwiązania w dziedzinie edycji genomu, do szybkiego badania przesiewowego mutacji nowotworowych. „Prime editing to transformacyjna technologia edycji genomu opracowana w 2019 roku przez dr Andrew Anzalone, profesora Davida Liu i współpracowników z Broad Institute of MIT i Harvard, która może zostać wykorzystana do przepisania DNA z niezwykłą precyzją” – wyjaśniła Sánchez-Rivera, która jest głównym autorem badania.

Edycja podstawowa a edycja podstawowa

Naukowcy pracowali nad udoskonaleniem technologii edycji genów CRISPR na potrzeby szeregu badań podstawowych i zastosowań klinicznych. W 2016 roku Liu i współpracownicy opracowali edycję bazową, rodzaj edycji genomu, który umożliwia naukowcom zaprojektowanie niektórych mutacji punktowych bez powodowania pęknięć dwuniciowego DNA, ale nie wszystkich możliwych mutacji punktowych.

„Istnieją dwa główne typy edytorów podstawowych, których można używać do projektowania mutacji przejściowych (C↔T, G↔A, A↔G, T↔C)” – wyjaśniła Sánchez-Rivera. Są to edytory zasad cytozyny (CBE), które umożliwiają konwersję zasad C – G i T – A, oraz edytory zasad adenozyny (ABE), które umożliwiają konwersję zasad A – T i G – C. „Niedawne prace łączące racjonalną inżynierię białek i ukierunkowaną ewolucję wykazały, że edytory baz „kanonicznych” można zaprojektować tak, aby instalowały mutacje transwersyjne (np. A·T do C·G)” – dodał Sánchez-Rivera. Opisał podstawowy montaż jako „niezwykle potężną i wydajną technologię”, która „dojrzała w niespotykanym dotąd tempie”, ale ma swoje ograniczenia.

Rodzaje mutacji, które można opracować za pomocą edycji zasad – przejścia nukleotydów i niektóre transwersje – niekoniecznie odzwierciedlają szeroki zakres wariantów, które mogą wystąpić w przypadku chorób ludzkich, takich jak rak.

„Chociaż znaczna część mutacji związanych z chorobą to przejścia i transwersje, wiele wariantów może stanowić mutanty złożone (tj. wpływające na ≥ dwa nukleotydy, w tym zarówno przejścia, jak i transwersje, a nukleotydy nie zawsze znajdują się obok siebie) lub indele, które są nie nadaje się do edycji podstawowej” – stwierdziła Sánchez-Rivera.

Wiadomo również, że redaktorzy bazowi instalują niepożądane mutacje obok zamierzonej witryny SNV.

Kontynuuj czytanie poniżej…

„Projekty RNA przewodnika po edycji bazy są również ograniczone do docelowej sekwencji protoprzerywnika i odpowiedniego rozmieszczenia docelowych nukleotydów w optymalnym oknie edycji, które różni się w zależności od różnych CBE i ABE” – dodała Sánchez-Rivera. „Wreszcie, zaprojektowanie RNA kierujących edycją bazy kontrolnej na miejscu w celu inżynierii cichych mutacji w genach kodujących białka może być bardzo przydatne w badaniach funkcjonalnych genów i wariantów”.

Edycja podstawowa pozwala uniknąć niektórych niedociągnięć edycji podstawowej. „Można go używać do projektowania praktycznie każdego rodzaju zmian genetycznych, w tym wszystkich typów SNV i indeli” – powiedziała Sánchez-Rivera.

Redaktorzy Prime to maszyny molekularne składające się z nikazy Cas9 połączonej z enzymem odwrotnej transkryptazy. Składnik Cas9 zapewnia wiązanie DNA specyficzne dla sekwencji i aktywność nickazy, podczas gdy odwrotna transkryptaza generuje cząsteczkę DNA kodującą pożądaną mutację, którą można wykorzystać do przepisania docelowego segmentu genomu.

„Najlepszy montaż jest często określany jako metoda„ wyszukaj i zamień ”, ponieważ głównym redaktorom polecono zaprojektować interesującą mutację w określonym miejscu genomu na podstawie instrukcji zakodowanych w głównym przewodniku edycji RNA (pegRNA) ”- wyjaśnił Sánchez-Rivera. „Te cząsteczki pegRNA zawierają zarówno protoprzerywnik (sekwencja „wyszukiwania”), jak i sekwencję przedłużającą 3′ (sekwencja „zastępowania”, która dyktuje zainstalowanie mutacji w miejscu). Ponieważ mutacja jest zakodowana w pegRNA, można zastosować edycję prime do zaprojektowania dowolnego typu SNV i małego indelu.

Pierwsza edycja ujawnia patogenność TP53 mutacje

Zespół MIT postawił hipotezę, że edycję pierwotną można wykorzystać do stworzenia ponad 99% wszystkich małych mutacji obserwowanych u pacjentów z rakiem, ale była jedna przeszkoda: pegRNA, które kierują enzymami CRISPR do „cięcia” w określonych obszarach genomu w edycji pierwotnej. różnią się poziomem wydajności i precyzji. „Aby obejść ten problem, opracowaliśmy test «czujnikowy» do edycji pierwotnej, który łączy poszczególne pegRNA z ich pokrewnymi miejscami docelowymi, które są starannie zaprojektowane tak, aby odzwierciedlić natywną sekwencję i kontekst genomowy genów i sekwencji, na które zamierzamy celować” – powiedziała Sánchez-Rivera .

Umożliwiło to zespołowi jednoczesne wdrożenie i określenie ilościowe edycji pierwotnej w tysiącach miejsc czujników i genów endogennych poprzez amplifikację, a następnie sekwencjonowanie miejsca docelowego czujnika z populacji komórek, które zostały zaprojektowane tak, aby wyrażały indywidualne czujniki edycji pierwotnej. W ramach badania weryfikującego koncepcję utworzono i przeszukano bibliotekę ~30 000 czujników edycji pierwotnej w komórkach gruczolakoraka płuc A549.

PegRNA zakodowane w czujnikach zostały zaprojektowane w celu uzyskania ponad 1000 wariantów TP53 gen supresorowy nowotworu, gen najczęściej zmutowany u pacjentów chorych na raka. „To pozwoliło nam przetestować hipotezę, że niektóre TP53 mutacje mogą nie działać w dominujący, negatywny sposób, a niektóre warianty wcześniej uważane za niepatogenne mogły zostać zignorowane lub błędnie sklasyfikowane z powodu braku odpowiednich technologii, które umożliwiłyby fizjologiczną ekspresję endogennych wariantów genetycznych” – stwierdziła Sánchez-Rivera.

Stwierdzono, że określone typy wariantów – zwłaszcza te, które wpływają na domenę oligomeryzacji białka p53 – są patogenne, co zaprzecza wnioskom z poprzednich badań, które opierały się na nadekspresji sztucznych kopii zmutowanych TP53 w komórkach. „To przestroga” – powiedział Samuel Gould, pierwszy autor badania i student w laboratorium Sánchez-Rivera: „Jest to przypadek, w którym fenotypy wywołane wariantami można zaobserwować tylko wtedy, gdy projektuje się je w ich naturalnym kontekście. a nie z tymi bardziej sztucznymi systemami.

„To tylko jeden przykład, ale przemawia za szerszą zasadą, że dzięki nowym technologiom edycji genomu będziemy mogli uzyskać dostęp do nowatorskiej biologii” – kontynuował.

„Wraz z pojawieniem się technologii sekwencjonowania w klinice będziemy mogli wykorzystać te informacje genetyczne do dostosowania terapii dla pacjentów cierpiących na nowotwory o określonym składzie genetycznym” – powiedziała Sánchez-Rivera. „To podejście oparte na najlepszym montażu może wszystko zmienić”.

Badanie różnych typów wariantów genetycznych

Chociaż Sánchez-Rivera i współpracownicy przesłuchali ponad 1000 mutacji TP53, nie opracowali i nie zbadali każdej możliwej mutacji, która mogłaby mieć wpływ na białko p53.

Możliwe jest również, że badane warianty genetyczne mogą wywoływać różne skutki w różnych typach komórek; praca ta skupiała się wyłącznie na komórkach gruczolakoraka płuc. Ograniczenia te, uznane przez badaczy, wyznaczają możliwe kierunki przyszłych badań naukowych.

Setki mutacji genetycznych w innych genach poza nią TP53 są powiązane z rakiem i innymi chorobami genetycznymi. Laboratorium Sánchez-Rivera rozszerza swoje podejście do badania różnych typów wariantów genetycznych, łącząc przyjęte tu metody z inżynierią chromosomów w celu zbadania, w jaki sposób duże rearanżacje chromosomów oddziałują z różnymi typami mutacji w progresji i terapii raka.

„Zachęcamy czytelników do zapoznania się z dodatkowymi materiałami towarzyszącymi naszemu manuskryptowi, w których załączamy szczegółowe protokoły eksperymentalne zaprojektowane tak, aby badacze mogli bezproblemowo zastosować nasze podejście. Opracowaliśmy także potok obliczeniowy o nazwie Prime Editing Guide Generator (PEGG), który jest publicznie dostępny i umożliwia naukowcom projektowanie i tworzenie bibliotek czujników prime editing” – powiedziała Sánchez-Rivera. „Na koniec, aby zapewnić przejrzystość danych, wszystkie skrypty analityczne i notesy Jupyter służące do generowania każdej liczby pojawiającej się w naszym badaniu są dostępne w repozytorium GitHub”.

O rozmówcy

Dr Francisco J. Sánchez-Rivera jest adiunktem biologii w Kock Institute for Integrative Cancer Research na MIT. Jego badania mają na celu zrozumienie, w jaki sposób zmienność genetyczna kształtuje normalną fizjologię i choroby, ze szczególnym uwzględnieniem raka. Jego laboratorium opracowuje i stosuje technologie inżynierii genomu, genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM oraz śledzenie linii pojedynczych komórek i podejścia omiczne w celu uzyskania kompleksowych biologicznych obrazów ewolucji choroby w rozdzielczości pojedynczej komórki. W ten sposób mają nadzieję dokonać praktycznych odkryć, które mogłyby utorować drogę lepszym strategiom terapeutycznym w leczeniu raka i innych chorób.

Odniesienie: Gould SI, Wuest AN, Dong K i in. Wysokoprzepustowa ocena wariantów genetycznych za pomocą bibliotek czujników do edycji pierwotnej. Nat Biotech. 2024. doi: 10.1038/s41587-024-02172-9