Nowa przestrzenna technologia genomiki funkcjonalnej, opracowana przez naukowców z Icahn School of Medicine w Mount Sinai w stanie Nowy Jork, umożliwia odkrycie genów regulujących zewnętrzne funkcje komórkowe na niespotykaną dotąd skalę i z rozdzielczością pojedynczych komórek. Technologia o nazwie Perturb-map wykorzystuje genetyczny kod kreskowy do oznaczania komórek nowotworowych, normalnych komórek sąsiednich i składników mikrośrodowiska guza bez usuwania ich z tkanki, co pozwala zachować architekturę przestrzenną.

Autorzy stosują swoją nową platformę do równoległego nokautu różnych genów w mysim modelu raka płuc, aby zrozumieć ich wpływ na wzrost, architekturę komórkową i skład immunologiczny guzów. Zespół łączy również mapę zaburzeń i transkryptomikę przestrzenną, aby analizować guzy edytowane za pomocą CRISPR.

Odkrycia te zostały opublikowane 14 marca 2022 r. w czasopiśmie Komórkaw artykule zatytułowanym „Genomika przestrzenna CRISPR identyfikuje regulatory mikrośrodowiska guza”.

Dr Brian Brown, profesor genetyki i nauk genomicznych w Icahn School of Medicine w Mount Sinai i główny autor badania, powiedział: „Artykuł ustanawia nową technologię, która pomoże przyspieszyć odkrywanie genów i ich funkcji. które służą do kontrolowania wielu różnych aspektów biologii nowotworów, takich jak morfologia guza, przerzuty i odporność. W dziedzinie immunologii raka i mikrośrodowiska guza istnieje wiele genetycznych badań przesiewowych, które wcześniej nie były możliwe”.

Sondowanie poza komórką

Zespół Browna został zainspirowany potrzebą zidentyfikowania genów, które (1) kontrolują procesy zewnątrzkomórkowe chroniące komórki nowotworowe i (2) których nie można dobrze zbadać za pomocą istniejących ekranów CRISPR, które najlepiej nadają się do badania procesów zachodzących w komórkach, takich jak genetyczne mechanizmy komórek proliferację, ekspresję białek i lekooporność.

Brown powiedział: „Informacje przestrzenne są w nich tracone [pooled CRISPR] ekrany. Jeśli nokaut określonego genu zmienił lokalne środowisko komórki, na przykład poprzez zmianę układu naczyniowego lub rekrutację większej liczby komórek T, informacja ta jest tracona, ponieważ nigdy nie widzimy, co znajdowało się na zewnątrz komórek nowotworowych”.

Platforma Perturb-map obrazuje komórki nowotworowe i normalne komórki w guzie i wokół niego, a także cząsteczki zewnątrzkomórkowe, takie jak mucyny. „Jesteśmy również w stanie przeszukiwać całe klasy genów, na przykład geny cytokin i chemokin, których nie można przeszukiwać za pomocą istniejących zbiorczych badań przesiewowych, ponieważ działają one poza komórką. Dzieje się tak dlatego, że nie musimy usuwać komórek z ich środowiska, aby zbadać, w jaki sposób nokaut konkretnego genu zmienił ich lokalne środowisko” – wyjaśnił Brown.

Nowy kod kreskowy

Perturb-map wykrywa nokauty genów za pośrednictwem CRISPR w tkankach przy użyciu technologii Pro-Code, która została opracowana w laboratorium Browna i opublikowana w 2018 roku Komórka papier. Platforma wykorzystuje multipleksowe obrazowanie, w którym tkanki są barwione przeciwciałami wykrywającymi kody kreskowe zwane „Pro-Codes”.

„Użyliśmy Pro-Codes do oznaczenia komórek niosących różne przewodniki RNA CRISPR. Przyjęliśmy techniki obrazowania multipleksowego, które umożliwiają wykrycie ponad 10 różnych białek na pojedynczym skrawku tkanki z rozdzielczością pojedynczej komórki, aby wykryć 120 komórek rakowych wykazujących ekspresję Pro-Code” – powiedział Brown.

Takie podejście umożliwia przestrzenną rozdzielczość setek zmian nowotworowych z różnymi nokautami genów in situ. W połączeniu z transkryptomiką przestrzenną platforma może określać stan molekularny zmian nowotworowych z nokautami różnych genów.

Na potrzeby obecnego badania badacze stworzyli nowy zestaw Pro-Codes z innym białkiem rusztowania, które nie jest związane z błoną, ale przemieszcza się do jądra. Nowe kody Pro, wraz z cyfrowym potokiem do rejestracji obrazów i segmentacji komórek, ulepszyły analizę obrazu w tym badaniu.

Odporność na nowotwory płuc

Dzięki zastosowaniu Perturb-map w modelach zwierzęcych naukowcy uzyskali wgląd w odporność na nowotwory płuc, co może pomóc w opracowaniu nowych immunoterapii. W szczególności autorzy stwierdzili, że utrata SOC1 zwiększyła wzrost guzów płuc, któremu towarzyszył paradoksalny wzrost naciekania komórek T do guzów. Rozwiązali zagadkę, badając dalej, aby odkryć, że nokaut SOCS1 prowadzi do jednoczesnego wzrostu PD-L1 na komórkach nowotworowych, który obezwładnia limfocyty T, które dostają się do guza.

„Kiedy leczyliśmy guzy z nokautem SOCS1 lekiem, który blokuje PD-L1, guzy skurczyły się bardziej niż grupy kontrolne” – powiedział Brown. Ta mechanistyczna wiedza może utorować drogę do połączenia blokady PD1/PD-L1 z hamowaniem SOCS1 jako skuteczniejszej strategii immunoterapeutycznej.

W równoległych eksperymentach badacze odkryli, że na komórkach rakowych utrata receptora wielofunkcyjnej cytokiny zwanej „transformującym czynnikiem wzrostu beta” zmieniła mikrośrodowisko guza w śluzowatą pulę wypełnioną śluzem usianą włóknistymi komórkami, które zapobiegały przedostawaniu się T. komórki. Zaburzenie genetyczne wskazywało na utratę genu receptora Tgfbr2, co zwiększyło dostępność cytokiny, która hamuje odpowiedź immunologiczną w mikrośrodowisku guza.

Następne kroki

W przyszłych badaniach zespół Browna zamierza zróżnicować, aby zbadać odporność nowotworu na inne rodzaje raka, w tym raka jajnika, trzustki i piersi. W tych różnych nowotworach zespół nadal koncentruje się na zrozumieniu genów, których guzy używają do osłabienia układu odpornościowego. Oprócz sondowania komórek rakowych, zespół stosuje Perturb-map do badania genów kontrolujących biologię komórek odpornościowych.

Zespół Browna zdeponował konstrukcje Pro-Code w Addgene, aby były szeroko dostępne. „Nie możemy się doczekać, co inni zrobią z tą technologią”
powiedział Brown.

Zastosowania tej nowej platformy mogą przyspieszyć odkrywanie nowych celów dla lepszych terapii przeciwnowotworowych.