Nowa metoda nauki specyficzne zmiany w DNA po replikacji zostały opublikowane jako raport techniczny w Biologia komórki przyrody. Badacze opracowali wysoce czułe, ilościowe podejście oparte na spektrometrii mas, zwane iDEMS (izolacja DNA przez znakowanie EdU dla spektrometrii mas).

„Nowością w naszej pracy jest to, że nie stosowaliśmy metod sekwencjonowania powszechnie stosowanych w tej dziedzinie, zamiast tego zastosowaliśmy spektrometrię mas, która po raz pierwszy zastosowała to podejście do pomiaru modyfikacji DNA na oczyszczonym, zreplikowanym DNA”, mówi dr Stewart-Morgan, współautor raportu, z laboratorium Groth w Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research (CPR) na Uniwersytecie w Kopenhadze.

To unikalne podejście jest wynikiem wspólnego projektu z laboratorium Hajkova w MRC London Institute of Medical Sciences (LMS). „W laboratorium Groth mamy doświadczenie w replikacji, a laboratorium Hajkova w badaniu metylacji DNA za pomocą spektrometrii mas. Myślę, że ta multidyscyplinarna współpraca jest w dużej mierze powodem, dla którego projekt odniósł taki sukces” – wyjaśnia dr Stewart-Morgan. „Wyniki naszych badań z wykorzystaniem iDEMS są definitywne i otwierają nowe możliwości dla przyszłych badań”.

Modyfikacje DNA i stabilność komórek

Genom to cały zestaw instrukcji DNA znajdujących się w komórce. Praktycznie wszystkie komórki w organizmie zawierają tę samą informację genetyczną – ale to, które geny ulegają ekspresji, zależy od funkcji komórki. Ta specyficzna dla komórki ekspresja genów jest regulowana przez epigenom komórki, który składa się z białek związanych z DNA, jak również bezpośrednich chemicznych modyfikacji DNA. Jednym z najważniejszych regulatorów epigenetycznych jest metylacja DNA – marker chemiczny, który wyłącza regiony genomu, które nie powinny ulegać ekspresji. Wzór tych markerów jest bardzo ważny dla utrzymania stabilności i tożsamości komórki: na przykład metylacja DNA w komórce wątroby będzie się różnić od wzoru metylacji DNA w komórce krwi.

Kiedy DNA jest replikowane podczas podziału komórki, znaczniki epigenetyczne związane z DNA, w tym metylacja DNA, ulegają rozcieńczeniu. Nowo utworzone nici DNA muszą ponownie ustalić poziom i wzorzec metylacji, aby zachować kontrolę nad ekspresją genów, stabilność genomu i pamięć epigenetyczną tożsamości komórki.

Jednak wiele o tym procesie jest nieznanych, a utrata metylacji DNA jest powszechną cechą komórek, które dzieliły się wiele razy, takich jak komórki rakowe, które są bardzo proliferacyjne i stare komórki, które replikowały się wiele razy w ciągu życia człowieka. W ostatnich latach kilka grup próbowało zbadać ten proces za pomocą metod sekwencjonowania, jednak dokładna kinetyka postreplikacyjnego utrzymania metylacji pozostała niejasna.

Przywrócenie metylacji

Korzystając z iDEMS, naukowcy odkryli, że poziomy metylacji DNA stale rosną po replikacji, a po 4 godzinach poziomy na zreplikowanym DNA i genomowym DNA były równe. Oznacza to, że proces ten przebiega w stałym, powolnym tempie. Jednak wyprzedza go podział komórek.

„Z biegiem czasu komórki nie mają wystarczająco dużo czasu na przywrócenie metylacji po replikacji, a metylacja genomu ostatecznie ulega osłabieniu. Po raz pierwszy pokazano bardzo wyraźną kinetykę ponownego ustanowienia metylacji. Ponadto widzieliśmy absolutną kwantyfikację poziomów metylacji DNA, co pozwoliło nam rozróżnić, które znaki metylacji zostały nowo ustalone. To dało nam pewność co do naszych pomiarów kinetycznych” — mówi Stewart-Morgan.

Drugi marker chemiczny

Naukowcy wykorzystali również iDEMS do zbadania drugiego markera – hydroksymetylacji DNA – który jest znacznie rzadszym markerem genomowym niż metylacja. Ich wyniki potwierdziły wcześniejsze badania, mówi Stewart-Morgan: „Odkryliśmy, że jedna nić DNA, matryca lub nić „rodzicielska”, zawsze ma więcej hydroksymetylacji niż druga nić „córkowa”, wspierając wcześniejsze prace, które wskazywały, że ten marker odróżnia DNA nici w zależności od wieku” – mówi.

„Odkryliśmy jednak również, że nie ma punktu, w którym poziomy hydroksymetylacji są równe między nicią rodzicielską i potomną w całym cyklu komórkowym. Otwiera to nowe pytania o to, jak ta różnica między niciami może być wykorzystywana przez komórki, na przykład podczas naprawy DNA”.

Potencjał iDEMS

Poprzez bezpośrednią ocenę ilościową modyfikacji DNA replikowanego DNA, iDEMS określa kinetykę metylacji i hydroksymetylacji DNA po replikacji DNA. „iDEMS to dynamiczne i bogate w informacje narzędzie do rozwiązywania ważnych pytań dotyczących utrzymania epigenomu i biologii modyfikacji DNA” — mówi Stewart-Morgan.

Patrząc w przyszłość, iDEMS będzie przydatny w profilowaniu dynamiki metylacji i hydroksymetylacji w różnych kontekstach komórkowych, w tym starzenia się i ewolucji raka. W porównaniu z danymi sekwencjonowania, spektrometria mas zapewnia prosty, szybki odczyt, a zatem iDEMS może być przydatny tam, gdzie kluczowa jest wydajność, na przykład w warunkach medycznych i badaniach nad lekami.

„Nasze wyniki podkreślają, jak ważne są nowe metody dla zrozumienia biologii przez więcej niż jedną soczewkę. iDEMS jest niezwykle elastyczny, ponieważ można go łączyć z innymi uznanymi metodami stosowanymi w biologii molekularnej, aby przyjrzeć się epigenomowi. Ta metoda dodaje zatem ważne narzędzie do zestawu technologii badających stabilność epigenomu”, podsumowuje Stewart-Morgan.

– Ta informacja prasowa została dostarczona przez Uniwersytet w Kopenhadze