Jedno z pierwszych zdjęć otwartego kompleksu, który powstaje, gdy RNAP napotyka DNA i rozpoczyna proces transkrypcji.

Każda żywa komórka przepisuje DNA na RNA. Proces ten rozpoczyna się, gdy enzym zwany polimerazą RNA (RNAP) zaciska się na DNA. W ciągu kilkuset milisekund podwójna helisa DNA rozwija się, tworząc węzeł znany jako bańka transkrypcyjna, dzięki czemu jeden odsłonięty łańcuch DNA może zostać skopiowany na komplementarny łańcuch RNA.

Jak RNAP dokonuje tego wyczynu, jest w dużej mierze nieznane. Migawka RNAP w trakcie otwierania tej bańki dostarczyłaby mnóstwa informacji, ale proces ten zachodzi zbyt szybko, aby obecna technologia mogła łatwo uchwycić wizualizacje tych struktur. Teraz nowe badanie w Natura Struktura i biologia molekularna opisuje E. coli RNAP w trakcie otwierania bańki transkrypcyjnej.

Wyniki, zarejestrowane w ciągu 500 milisekund od zmieszania RNAP z DNA, rzucają światło na podstawowe mechanizmy transkrypcji i odpowiadają na od dawna zadawane pytania dotyczące mechanizmu inicjacji i znaczenia jego poszczególnych etapów. „To pierwszy raz, kiedy ktoś był w stanie uchwycić przejściowe kompleksy transkrypcyjne w czasie rzeczywistym” — mówi pierwsza autorka Ruth Saecker, specjalistka ds. badań w laboratorium Setha Darsta w Rockefeller. „Zrozumienie tego procesu jest kluczowe, ponieważ jest to główny krok regulacyjny w ekspresji genów”.

Bezprecedensowy widok

Darst jako pierwszy opisał strukturę bakteryjnego RNAP, a wydobywanie jego drobniejszych szczegółów pozostaje głównym celem jego laboratorium. Podczas gdy dziesięciolecia pracy wykazały, że wiązanie RNAP do określonej sekwencji DNA uruchamia serię kroków, które otwierają bańkę, sposób, w jaki RNAP rozdziela nici i umieszcza jedną nić w jej aktywnym miejscu, pozostaje przedmiotem gorących debat.

Wczesne prace w terenie sugerowały, że otwieranie pęcherzyków działa jako krytyczne spowolnienie procesu, dyktując, jak szybko RNAP może przejść do syntezy RNA. Późniejsze wyniki w terenie zakwestionowały ten pogląd i pojawiło się wiele teorii na temat natury tego ograniczającego szybkość kroku. „Wiedzieliśmy z innych technik biologicznych, że gdy RNAP po raz pierwszy napotyka DNA, tworzy wiele kompleksów pośrednich, które są silnie regulowane” — mówi współautor Andreas Mueller, adiunkt w laboratorium. „Ale ta część procesu może nastąpić w mniej niż sekundę, a my nie byliśmy w stanie uchwycić struktur w tak krótkiej skali czasowej”.

Aby lepiej zrozumieć te pośrednie kompleksy, zespół nawiązał współpracę z kolegami z New York Structural Biology Center, którzy opracowali zrobotyzowany system oparty na druku atramentowym, który mógł szybko przygotowywać próbki biologiczne do analizy kriomikroskopii elektronowej. Dzięki temu partnerstwu zespół uchwycił kompleksy tworzące się w ciągu pierwszych 100 do 500 milisekund spotkania RNAP z DNA, uzyskując obrazy czterech odrębnych pośrednich kompleksów z wystarczającą szczegółowością, aby umożliwić analizę.

Po raz pierwszy jasny obraz zmian strukturalnych i pośredników, które powstają na początkowych etapach wiązania polimerazy RNA z DNA, stał się jasny. „Technologia była niezwykle ważna dla tego eksperymentu” — mówi Saecker. „Bez możliwości szybkiego mieszania DNA i RNAP i rejestrowania obrazu w czasie rzeczywistym, te wyniki nie istnieją”.

Zajmowanie pozycji

Po przeanalizowaniu tych obrazów, zespołowi udało się naszkicować sekwencję zdarzeń pokazującą, jak RNAP oddziałuje z pasmami DNA podczas ich rozdzielania, na wcześniej niewidocznych poziomach szczegółowości. Gdy DNA się rozwija, RNAP stopniowo chwyta jedno z pasm DNA, aby zapobiec ponownemu połączeniu się podwójnej helisy. Każda nowa interakcja powoduje zmianę kształtu RNAP, umożliwiając utworzenie większej liczby połączeń białko-DNA. Obejmuje to wypchnięcie jednej części białka, która blokuje DNA przed wejściem do aktywnego miejsca RNAP. W ten sposób powstaje stabilna bańka transkrypcyjna.

Zespół proponuje, że etapem ograniczającym szybkość transkrypcji może być pozycjonowanie nici matrycy DNA w miejscu aktywnym enzymu RNAP. Ten etap obejmuje pokonanie znaczących barier energetycznych i przearanżowanie kilku komponentów. Przyszłe badania będą miały na celu potwierdzenie tej nowej hipotezy i zbadanie innych etapów transkrypcji.

„W tym badaniu przyjrzeliśmy się tylko najwcześniejszym etapom” — mówi Mueller. „Następnie mamy nadzieję przyjrzeć się innym kompleksom, późniejszym punktom czasowym i dodatkowym etapom cyklu transkrypcji”.

Oprócz rozwiązania sprzecznych teorii na temat tego, jak wychwytywane są nici DNA, wyniki te podkreślają wartość nowej metody, która może wychwytywać zdarzenia molekularne zachodzące w ciągu milisekund w czasie rzeczywistym. Technologia ta umożliwi wiele kolejnych badań tego typu, pomagając naukowcom wizualizować dynamiczne interakcje w systemach biologicznych.

„Jeśli chcemy zrozumieć jeden z najbardziej podstawowych procesów w życiu, coś, co robią wszystkie komórki, musimy zrozumieć, w jaki sposób regulowane są jego postęp i szybkość” — mówi Darst. „Gdy to poznamy, będziemy mieli znacznie jaśniejszy obraz tego, jak rozpoczyna się transkrypcja”.