Zobacz, jak naukowcy odkrywają mechanizmy zwyrodnienia siatkówki i identyfikują nowe cele interwencji terapeutycznej

---

Dr Yu Holly Chen, adiunkt, University of Alabama w Birmingham i dr Rinki Ratnapriya, adiunkt, Baylor College of Medicine

Około 2,2 miliarda ludzi na całym świecie cierpi na zaburzenia widzenia, przy czym zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest główną przyczyną ślepoty wśród osób starszych, spowodowaną śmiercią komórek fotoreceptorów głównie w obszarze plamki żółtej siatkówki. Badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) ujawniły udział wielu powszechnych wariantów genetycznych w AMD. Jednak wysiłki mające na celu zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw tych wariantów zostały udaremnione przez brak odpowiedniego modelu choroby, który dokładnie naśladuje właściwy kontekst choroby.

Organoidy, samoorganizujące się trójwymiarowe modele komórkowe pochodzące z komórek macierzystych, otworzyły możliwość replikacji ludzkiego oka w celu dokładnego zbadania i zbadania utraty wzroku. Teraz modele te są łączone z najnowszymi technologiami CRISPR, aby wprowadzić precyzyjne edycje genetyczne i zbadać rolę poszczególnych wariantów w mechanizmach neurodegeneracji siatkówki.

W tym SelectScience^® rozmawiamy z dr Yu Holly Chen, adiunktem na University of Alabama w Birmingham i dr Rinki Ratnapriya, adiunktem w Baylor College of Medicine, aby dowiedzieć się, w jaki sposób łączą oni swoje doświadczenie w opracowywaniu modeli in vivo w przypadku chorób siatkówki i stosując metody oparte na sekwencjonowaniu całego genomu, aby pogłębić naszą wiedzę na temat mechanizmów choroby AMD i zbadać potencjalne podejścia terapeutyczne.

Zbliżanie się do genetycznych winowajców

Badania asocjacyjne obejmujące cały genom zidentyfikowały 34 loci związane z AMD. Ponieważ jednak większość tych wariantów znajduje się w niekodującym regionie genomu, identyfikacja wariantów przyczynowych, genów docelowych i mechanizmów, za pomocą których pośredniczą w fenotypach chorób, pozostaje kluczowym wyzwaniem.

Organoidy siatkówki, które zasadniczo naśladują rozwój i morfologię ludzkiej siatkówki, umożliwiają podsumowanie mechanizmów i progresji choroby in vitro oraz zbadanie roli poszczególnych wariantów związanych z AMD. „Ponieważ ludzie mają wiele różnych wariantów, badanie ich w komórkach wyhodowanych w laboratorium oferuje wyjątkowe okno do badania mechanizmów choroby”, wyjaśnia Ratnapriya. „Doprowadziło to do naszej współpracy z dr Chen, który jest ekspertem w opracowywaniu modeli in vivo dla chorób siatkówki”.

Badania Chen koncentrują się na dziedzicznej degeneracji siatkówki, a konkretnie na tym, jak mutacje genetyczne prowadzą do defektów struktur czuciowych – znanych jako pierwotne rzęski – w oku. „Używamy organoidów siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, które tworzą miniaturowe tkanki 3D, które strukturalnie i nieco funkcjonalnie przypominają siatkówkę in vivo” – mówi. „Oferują one obiecującą platformę do badania mechanizmów chorobowych i opracowywania terapii w kontekście ludzkim”.

„Rinki i ja odbyliśmy staż podoktorancki w tym samym laboratorium w National Eye Institute (NEI), a nasza wiedza i zainteresowania badawcze wzajemnie się uzupełniają” — kontynuuje Chen. „Pracując razem, mamy nadzieję połączyć tę platformę opartą na ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych z technikami genomicznymi, aby pogłębić naszą wiedzę na temat AMD i zbadać różne podejścia terapeutyczne”.

---

Immunobarwione organoidy siatkówki pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). ©University of Alabama w Birmingham

Inżynieria CRISPR izogenicznych organoidów

Współpraca Chena i Ratnapriyi ma na celu odkrycie mechanizmów, za pomocą których niekodujące warianty regulują ekspresję genów, które mogą odgrywać rolę w AMD. W tym celu naukowcy zamierzają wygenerować izogeniczne modele organoidów – linie komórkowe o takim samym składzie genetycznym, poza specyficznymi modyfikacjami genetycznymi będącymi przedmiotem zainteresowania. „Planujemy wygenerować linie izogeniczne z wariantami związanymi z AMD przy użyciu edycji genów CRISPR”, mówi Ratnapriya. „Robiąc to, mamy nadzieję zbadać długoterminowy wpływ tych wariantów na ekspresję genów, sieci regulacyjne i mechanizmy chorobowe”.

Ratnapriya dalej wyjaśnia wartość technologii CRISPR w tej pracy. „Edycja genów oparta na CRISPR, a także aktywacja genów (CRISPRa) i hamowanie genów (CRISPRi) oferuje wiele strategii badania elementów regulatorowych zawierających warianty przyczynowe w liniach komórkowych istotnych dla choroby w celu zbadania ich funkcji, genów docelowych i ogólnej roli w powodowaniu fenotypów chorobowych” – mówi.

„W porównaniu z innymi narzędziami do edycji genomu, takimi jak TALEN, CRISPR jest bardziej wszechstronnym i łatwiejszym do zaprojektowania podejściem”, dodaje Chen, zauważając, jak postęp w technologiach CRISPR znacznie uprościł generowanie izogenicznych modeli chorób ludzkich in vitro.

„Oprócz współpracy z Rinki, używam również narzędzi CRISPR do generowania modeli pochodzących z hPSC z nokautem izogenicznym i warunkowym, aby przeanalizować rolę określonych genów i typów komórek w postępie choroby” — dodaje.

Eksperymentalne wyzwania

Pomimo postępu w precyzji i wydajności edycji genów opartej na CRISPR, badania Chena i Ratnapriyi nie są pozbawione wyzwań. „Podobnie jak większość złożonych chorób, AMD jest również spowodowane skumulowanym wpływem wielu wariantów przyczynowych, których modelowanie w hodowli komórkowej pozostaje technicznie trudne” – mówi Ratnapriya. „Wykorzystanie CRISPR do śledzenia genów kandydujących wymaga również wcześniejszej wiedzy na temat tego, które testy funkcjonalne są najbardziej istotne dla choroby, a które nie zawsze są dobrze rozumiane”.

„Niektórzy badacze wahają się przed użyciem narzędzi do edycji genów opartych na CRISPR ze względu na obawy dotyczące efektów poza celem lub innych pułapek” – dodaje Chen. „Chociaż rozumiem, że są to obecne wady tego podejścia, ważne jest, aby pamiętać, że każda nowa technologia ma początkowe trudności, które z czasem można rozwiązać i ulepszyć. Na przykład obecnie opracowano różne szczepy białek Cas9 w celu zmniejszenia efektów poza celem i poprawy wydajności. Gdybyśmy nie próbowali niczego nowego, nie byłoby żadnej poprawy”.

Przyszłość edycji genów

Oprócz opracowywania modeli chorób, Chen i Ratnapriya widzą wielką obietnicę w zastosowaniu edycji genomu za pośrednictwem CRISPR Cas9 w zastosowaniach terapeutycznych, gdzie można by ją potencjalnie wykorzystać do korygowania mutacji powodujących choroby związanych z utratą wzroku u ludzi. „Dzięki poprawie wydajności i specyficzności w przyszłości moglibyśmy bezpośrednio wstrzykiwać maszynerię do edycji genów do tkanek związanych z chorobą, aby korygować mutacje na miejscu”, zachwyca się Chen.

„Istnieje kilka wyzwań związanych z zastosowaniami technologii edycji genów u ludzi, takich jak celowanie poza cel, polimorfizm, optymalizacja metody dostarczania i etyka. Jednak postęp techniczny w edycji genów stwarza realną szansę na zapobieganie i leczenie chorób dziedzicznych” – dodaje Ratnapriya.

„Edycja genów przyspieszyła badania nad regulacją ekspresji genów, modyfikacjami epigenetycznymi, opracowywaniem leków terapeutycznych, funkcjonalnymi badaniami przesiewowymi genów i diagnostyką genów” — kontynuuje. „Długoterminowy cel wykorzystania edycji genomu w profilaktyce i leczeniu chorób pozostaje atrakcyjną drogą, a moją radą dla innych badaczy jest dalsze przesuwanie granic i zadawanie trafnych pytań, aby udostępnić edycję genów jako opcję terapeutyczną nowej generacji”.