W niedawnym badaniu opublikowanym w Genetyka naturyNaukowcy przeprowadzili edycję genomu nasyceniowego (SGE) genu białka 1 związanego z BRCA1 (BAP1), którego dysfunkcja wiąże się z rakiem i zaburzeniami rozwoju neurologicznego.

Tło

Mutacje dziedzicznej utraty funkcji (LOF) w genie BAP1 prowadzą do podatności na guzy, a niektóre z nich są powiązane z problemami neurorozwojowymi. Warianty o nieznanym znaczeniu tworzą autosomalny dominujący zespół predyspozycji do guzów, który powoduje powikłania w trakcie leczenia pacjenta.

Ostatnie kryteria przesiewowe dla osób z patogennymi mutacjami linii zarodkowej w BAP1 są kluczowe dla identyfikacji grup ryzyka i poprawy zaleceń dotyczących monitorowania. Identyfikacja mutacji somatycznych BAP1 typu disruptive w nowotworach złośliwych może pomóc w dostosowanej terapii nowotworowej.

O badaniu

W niniejszym badaniu naukowcy wykorzystali SGE do scharakteryzowania wariantów pojedynczych nukleotydów w genie BAP1, co usprawnia działania medycyny precyzyjnej.

Naukowcy skupili się na badaniu wariantów o nieznanym znaczeniu (VUS) w genie BAP1, które są krytyczne dla leczenia pacjentów. Badali funkcję polimorfizmów linii zarodkowej i somatycznej BAP1 w skłonności do nowotworów i ukierunkowanych terapiach onkologicznych. Badali korelacje wariantów BAP1 z nowotworami, takimi jak czerniak skóry, czerniak błony naczyniowej oka, rak dróg żółciowych, mezotelioma, oponiak i rak nerki.

Naukowcy przeprowadzili eksperymenty na 18 108 odrębnych wariantach, z których 6196 wykazało aberracyjne funkcjonalności. Następnie wykorzystali te ustalenia do oceny relacji fenotypowych w United Kingdom Biobank, populacyjnym zbiorze guzów, rodowodach nowotworów i ClinVar.

Naukowcy opracowali szczep HAP1 DNA ligazy 4 (LIG4) knockout (KO), który obejmował genomową integrację klonalnie generowanego Cas9 (HAP1-A5). Udoskonalili plazmidy i metody transfeccji, przeszukując wszystkie eksony kodujące BAP1 w pięciu okresach. Ponadto przeprowadzili dwa różne badania, aby ukierunkować każdy obszar SGE.

Sprawność komórkowa została wykorzystana jako biologiczny odczyt funkcji BAP1, pokazując jej znaczenie i skuteczność SGE w komórkach HAP1. Przeprowadzono skoncentrowany, regularnie rozproszony, krótki palindromiczny powtórzeń-białko skojarzone z białkiem 9 (CRISPR-Cas9), z 193 sgRNA i bibliotekami wariantów rozmieszczonymi we wszystkich 22 obszarach docelowych BAP1.

Naukowcy przeprowadzili analizy funkcjonalne architektury i konserwacji genów, klasyfikując warianty do kategorii funkcjonalnych. Warianty ze współczynnikiem fałszywych odkryć (FDR) ≥0,01 sklasyfikowano jako niezmienione, natomiast te ze współczynnikiem FDR ≤0,01 i ujemnym wynikiem funkcjonalnym sklasyfikowano jako zubożone. Warianty ze współczynnikiem FDR ≤0,01 i dodatnim wynikiem funkcjonalnym sklasyfikowano jako wzbogacone. Naukowcy porównali tę miarę z wynikami SGE i przetestowali niezawodność wyników funkcjonalnych i klasyfikacji dla każdego wariantu, porównując log2-krotne zmiany (LFC) z różnych badań edycji genomu.

Naukowcy porównali test BAP1 SGE z ramami dowodowymi American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG), aby ustalić jego przydatność do interpretacji wariantów. Zbadali warianty BAP1 w raku i rozwoju neurologicznym i sklasyfikowali je jako wysoce niedoborowe lub lekko zubożone. Użyli badania asocjacyjnego w całym fenomenie (PheWAS), aby zidentyfikować niedoborowe warianty i opracowali cechy fenotypowe typu nowotworowego oraz maski testowe obciążenia rzadkimi wariantami.

Ocenili również związek między mutacjami UK Biobank BAP1 a ilościowymi aspektami czerniaków błony naczyniowej oka, wykorzystując dane sekwencjonowania kwasu rybonukleinowego (RNA-seq) z Cancer Genome Atlas. Przeanalizowali również dane sekwencjonowania guzów z 394 756 próbek pacjentów w bazie danych Foundation Medicine, aby zidentyfikować nowe warianty BAP1.

Wyniki

Destrukcyjne, niesynonimiczne mutacje linii zarodkowej BAP1 były powiązane z diagnozami raka i zwiększonymi poziomami insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 (IGF-1), co wskazuje na możliwy mechanizm patogenny i cel terapeutyczny. Wynik funkcjonalny dokładnie klasyfikował warianty, z czułością >99% i swoistością >98% oraz wartością pola pod krzywą (AUC) >0,999.

Zmieniona metoda SGE zwiększyła jakość eksperymentu poprzez ustalenie niezbędności BAP1 w linii komórkowej HAP1 LIG4 KO, zwiększenie aktywności Cas9 i utrzymanie solidnej haploidii. Udoskonalona procedura SGE poprawiła wydajność transfeccji wśród komórek HAP1 do ponad 60% z poniżej 5,0%. Niezbędność BAP1 umożliwiła rozdzielenie konsekwencji mutacji, przy czym warianty stop-gained i frameshift miały głównie negatywne wyniki funkcjonalne.

Warianty missense i delecje kodonów generowały wyniki o rozkładzie bimodalnym, umożliwiając badaczom określenie krytycznych reszt i domen białka BAP1. Spośród 18 108 wariantów BAP1 11 912 było stałych, 5665 zubożonych i 531 wzbogaconych. Niezmienione warianty nie otrzymały żadnych ocen funkcjonalnych, ale wzbogacone warianty uzyskały lepsze wyniki. Zespół zaobserwował kilka wariantów synonimicznych zubożonych na ekranie. Warianty zubożone typu synonimicznego wykazały znacznie wyższe wyniki SpliceAI niż niezmienione warianty synonimiczne. Wersje zubożone mają szerszy zakres wyników.

Konserwowana domena N-końcowa UCH BAP1 była bardziej odporna na mutacje missense i delecje kodonów. Klasyfikacje funkcjonalne obliczone przy użyciu biblioteki A lub B LFC i FDR dały 90% zgodności klasyfikacji wariantów. Naukowcy odkryli, że 99,8% wariantów w zestawie prawdy patogeniczności wykazało przewidywane wyczerpanie, podczas gdy 97% było niezmienionych lub wzbogaconych. Klasyfikacja funkcjonalna testów i SGE jest dość podobna, co pozwala na jednoczesną identyfikację prawdopodobnego hypomorfa.

Wniosek

Badanie wykazało, że kompleksowa ocena funkcjonalna loci z wykorzystaniem SGE może poprawić diagnozę pacjentów, biologiczne zrozumienie przyczyn chorób i podstawową wiedzę na temat funkcji genów i białek.