W niedawnym badaniu opublikowanym w Nature Microbiology naukowcy opracowali ukierunkowane podejście oparte na dokładnym sekwencjonowaniu konsensusowym kwasu rybonukleinowego (RNA) (tARC-seq), aby precyzyjnie określić częstotliwość i typ mutacji wirusa SARS-CoV-2 w hodowli komórkowej i próbki kliniczne.

Badanie: Ukierunkowane dokładne sekwencjonowanie konsensusowe RNA (tARC-seq) ujawnia mechanizmy błędu replikacji wpływającego na dywergencję SARS-CoV-2. Źródło zdjęcia: Andrii Vodolazhskyi/Shutterstock.com

Tło

SARS-CoV-2 replikuje się za pośrednictwem zależnych od RNA polimeraz RNA (RdRp), które są podatne na błędy. Monitorowanie błędów replikacji ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia rozwoju wirusa, ale istniejące podejścia są niewystarczające, aby zidentyfikować rzadkie zmiany kwasu rybonukleinowego de novo.

Podczas pandemii choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) współczynnik mutacji SARS-CoV-2 wahał się od 10–6 do 10–4 na zasadę na komórkę. Aktywność korygująca egzonukleazy zwiększa współczynnik mutacji, co prowadzi do średnio dwóch mutacji w każdym genomie miesięcznie.

O badaniu

W niniejszym badaniu naukowcy stworzyli tARC-seq, aby zbadać mechanizmy błędów replikacji wpływających na rozbieżność SARS-CoV-2.

Podejście tARC-seq łączy cechy ARC-seq z technologią przechwytywania hybrydowego w celu ulepszenia celów, umożliwiając dogłębne badanie wariantowe tych próbek.

Naukowcy wykorzystali tARC-seq do odkrycia odmian RNA w oryginalnym szczepie SARS-CoV-2 typu dzikiego (WT), wariantach SARS-CoV-2 Alpha i Omicron oraz próbkach klinicznych i Omicron.

Naukowcy zsekwencjonowali RNA wirusa SARS-CoV-2 typu dzikiego po 4,0 cyklach infekcyjnych, uzyskując 9,0 × 10⁵ jednostki tworzące łysinki (pf.u.) RNA SARS-CoV-2. Dodali E coli informacyjny RNA (mRNA) jako nośnik enzymu do przygotowania bibliotek. Wychwyt hybrydowy wykrył RNA E. coli w bibliotece genetycznej, które badacze zbadali indywidualnie i wykorzystali jako kontrolę wewnętrzną.

Aby dokładniej zbadać selekcję danych dotyczących sekwencjonowania tARC, badacze zmapowali częstotliwości wariantów niesensownych, synonimicznych i niesynonimicznych zidentyfikowanych w wyniku sekwencjonowania tARC w obrębie białka monstrukturalnego 12 (nsp12), kluczowego genu kodującego SARS-CoV-2 RdRp.

Określili punktację działania ewolucyjnego (EA) i częstotliwości zmienności dla nonsensownych i niesynonimicznych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) występujących w przypadku SARS-CoV-2 spike (S) i nsp12. Obliczyli także średnią częstość mutacji otwartych ramek odczytu (ORF) w wirusie typu dzikiego, w podziale na typ mutacji i zmiany zasad.

Naukowcy zbadali losowe rozmieszczenie wariantów RNA w genomie SARS-CoV-2, korzystając z szacunków opartych na lokalizacji i analizy tożsamości nukleotydów. Zastosowali także tARC-seq w dwóch próbkach klinicznych, aby poszukać mutacji de novo spowodowanych spontaniczną infekcją.

Dopasowali dziesięć najczęstszych mutacji C>TT i G>AA do znanych miejsc edycji A3A w wirusie typu dzikiego. Naukowcy zbadali wszystkie wystąpienia SID z ≥2 nukleotydami komplementarności pomiędzy miejscami dawcy i akceptora poniżej w WT, Alpha i Omicron. Zbadali częstość występowania mutacji TC>TT w całym genomie w komórkach WT-Vero.

Wyniki

Naukowcy odkryli 2,7 × 10-5 (średnio) błędów de novo na cykl w przypadku wirusa SARS-CoV-2, przy czym odchylenia C>T nie wynikają głównie z enzymu edytującego mRNA apolipoproteiny B, ale z edycji polipeptydu katalitycznego (APOBEC).

Zidentyfikowali chłodne i gorące obszary w genomie, w zależności od niskiego lub wysokiego stężenia GC, i zwrócili uwagę na regiony regulujące transkrypcję jako miejsca bardziej podatne na błędy. Podejście tARC-seq umożliwia wykrywanie zmian szablonów, takich jak delecje, insercje i skomplikowane zmiany.

Wirus WT ma 1,1 × 10⁻⁴ Różnice w RNA na zasadę, z podstawieniami zasad stanowiącymi większość (8,4 x 10,4).⁻⁵), po których następują wstawki (2,5 × 10^-6) i delecje (2,1 × 10,⁻⁵). Przejścia G > A i C > T dominują w krajobrazie mutacji wirusowych, przyczyniając się do 9,0% i 44% wszystkich wystąpień.

Spektrum mutacji i częstotliwość odczytów nietypowych dla SARS-CoV-2 typu dzikiego różnią się od odczytów E. coli, co pokazuje, że te zdarzenia mutacyjne są prawdziwymi zmianami wirusowymi, a nie artefaktami przygotowania biblioteki.

Losowe rozkłady i porównywalne wskaźniki wszystkich trzech typów mutacji nsp12 sugerują, że większość zmian RNA znalezionych w wyniku sekwencjonowania tARC to błędy replikacji typu de novo. Naukowcy nie odkryli żadnych różnic w częstotliwościach wariantów pomiędzy SNP o niskich wynikach działania ewolucyjnego (szacunkowe efekty neutralne) a tymi o wysokich wartościach EA (szacowane szkodliwe skutki) w podstawowym zakresie podstawienia, co wskazuje, że selekcja ma ograniczony wpływ.

Wskaźniki wariantów różnią się znacznie w zależności od lokalizacji, przy czym 643 loci w duplikatach wirusa WT wykazuje znacznie wyższe częstotliwości podstawień zasad, a 80 powtarza się w obu replikach WT.

Naukowcy nie stwierdzili nakładania się hotspotów C>TT sekwencjonowania tARC o najwyższej częstotliwości i regionów edycji A3A w wirusie typu dzikiego. Częstotliwości C>TT sekwencjonowania tARC w regionach edycji A3A były niższe niż częstotliwości C>TT gorących punktów C>TT sekwencjonowania tARC o jeden do dwóch rzędów wielkości.

W badaniu zwrócono uwagę na tARC-seq, specjalistyczne podejście do sekwencjonowania, mające na celu zbadanie błędów replikacji, które wpływają na dywergencję SARS-CoV-2. Podejście to selektywnie odczytuje określone cząsteczki RNA w celu wygenerowania sekwencji konsensusowej, umożliwiając badaczom wykrycie i ocenę drobnych różnic i błędów podczas replikacji wirusa.

Może także wykrywać insercje i delecje de novo w SARS-CoV-2 powstałe w wyniku zakażenia hodowli komórkowej, co potwierdza ustalenia z ogólnoświatowego sekwencjonowania pandemii.

W badaniu odkryto również, że SARS-CoV-2 posiada możliwości korekty egzonukleazy, co może pomóc w zrozumieniu krytycznej funkcji ExoN.